rna聚合酶i介导转录的tbsv病毒表达载体研究

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1、宁夏大学硕士学位论文中英文缩略词表NCnitrocellulosefiltermembrane硝酸纤维素膜HRPTISRNApolHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶Transeriptioninitiationsite转录起始位点RNApolymcraseVIIRNA聚合酶宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述随着基因工程技术的发展，利Hj植物作为生物反应器生产外源蛋白(如抗体、亚单位疫苗、药用蛋白等)的研究因其广阔地商业前景在世界范围内受到广泛地关注Il】。植物RNA病毒载体表达系统是近年发展起来的一类

2、以植物作为反应器的新型表达系统。此系统将外源基因整合到植物病毒基因组中，用改造后的重组病毒感染寄主植物，外源基因随着病毒在植物体内的复制和扩散而得到高效表达【21。该表达系统在短时间内就可以生产大量成本低廉、安全的目的蛋白，这是目前现有任何一个表达系统都不可能实现的。植物病毒载体表达系统已经成为利用植物生产外源蛋白的一个有潜力的新平刽引。大部分的蛋白质都是由多条多肽链构成的，用同一病毒载体在细胞内无法同时高效率地表达两条多肽链：用不相互竞争的不同病毒在同一个细胞中表达完整的抗体分子获得了成功，意味着开发多种植物病毒表达体系

3、的必要性。而目前在植物RNA病毒瞬时表达载体研究中，成功的设计多局限于一些寄主范围J“，生物危害严重的植物RNA病毒类群上，如烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)和马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)等。因此重组载体的生物安全性成为此领域的一个共性问题，极大地制约了植物RNA瞬时表达载体的商业化应用进程。鉴于上述研究现状，开发一种集聚安全性与高效性的新型表达载体已成为众多学者的研究目标。由于真核生物II型启动子研究较为透彻，现有的植物病毒表达系统多采用II型启动子构建载体。而将活性高、特

4、异性的I型启动子置于一个适宜的重组植物病毒上游构建表达载体为解决上述问题提供了一条新的思路。1．1真核生物I型启动子与II型启动子概述真核生物细胞中有三种转录方式，分别由三种RNA聚合酶(I、II和III)催化，每种酶涉及到合成不同类型的RNA【4l。RNApolI是唯一在核仁中的RNA聚合酶，它催化合成两种人分子rRNA(28SrRNAs和18SrRNAs)和2种小分子rRNA中的一种(5．8SrRNAs)，这些分子都在核糖体上。RNApol11只在核质中。它涉及mRNA和某些snRNAs(核内小分子RNA，smallm

5、uclearRNA)，还有RNA的前体(hnRNA：heterogeneousmuclearRNA，核内不均一RNA)。RNApolIII也在核质中，它主要合成tRNAs、5SRNA和snRNA(表1．1)。三种聚合酶分别有三种不同的启动子与其相对应。表1．1真核生物的三种RNA聚合酶的特点RNA聚合酶1只转录rRNA一种基因，包括5．8S、18S和28SrRNA。三种rRNA的基因(rDNA)成簇存在，共同转录在一个转录产物上，然后经加工成为三种rRNA。RNA宁夏大学硕士学位论文第一章文献综述聚合酶I型启动子介导的转录

6、是生物的一种重要调节机制，它可以通过控制合成大量的核糖体从而控制细胞内各种蛋白的合成【5】。在动物和酵母的生长活跃的细胞中，RNApolI驱动的rRNA合成占全部细胞RNA产物的50％[6】，其活性远高RNAPolII与RNAPolIII。在真核生物中，核糖体DNA(rDNA)位于核仁组织区，由18S，5．8S和25．28SrRNA基因组成的串联重复单位和几个非转录间隔区，rRNA基因的间隔区(IGS)包含一个转录起始位点(TIS)，转录终止位点(TTS)，和各种调节元件等【7】。启动子便位于这些基因间隔区内。许多植物的r

7、DNA间隔区已被分离，它们都有一段保守的序列TATA(G)TA(N)GGG[81。在IGS的3’端有一段在茄科中非常保守的序列GAGGTYITr[91。图1-1植物rDNA结构模式图(a)植物rDNA区域染色体定位。(b)18S．5．8S．26S串联重复序列。各编码区被基因间隔区0GS)分开，包括5崆嵩与3端外转录间隔区(externaltranscribedspacer，EYS)．两个外转录间隔区被非转录区分开(nontranscribcdregion，NTS)，转录起始位点位于5’ETS起始端。小亚基(18s)与大亚基

8、(5．8S和26S)被内部转录间隔区1(ITSl)与内部转录间隔区2(ITS2)分开。与RNApolII型启动子和RNApolIII型启动子不同的是，RNApolI型启动子介导的转录具有种属特异性【8】。转录因子SLl包含TATA结合蛋白(TATA．bindingprotein，TaP)和三个TBP关联