反转录病毒载体介导egfp基因在sk-n-sh神经母细胞瘤细胞的表达

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1、http://www.paper.edu.cn阿反转录病毒载体介导EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞的表达1刘朝晖，许杰华，冯改丰，胡海涛西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西西安(710061)E-mail：huht@mail.xjtu.edu.cn摘要：目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的反转录病毒载体并且探 讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携 带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞，计数 NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度。使用RV载体感染SK

2、-N-SH细胞，通过流 式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体 RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定 转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到 30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染，在转基因细胞株外源基因的 表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。关键词：SK-N-SH神经母细胞瘤细胞，增强型绿色荧光蛋白，反转录病毒载体体外细胞学实验是疾病的发病和治疗研究中一个重要的手段。它可以根据需要有效地控制实

3、验条件，能在短期内获得大量条件相同、性状相似且相对均一的实验样本。因此不断在医学各研究领域广泛应用，在实践中取得了大量有意义的实验资料。SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株属于神经系统来源的肿瘤细胞系[1]，它的可传代性克服了神经元这种分化终末细胞在体外无法分裂增殖传代，生长时间短的缺点。而且SK-N-SH细胞在细胞形态、生理和生化功能方面与原代培养的神经元更为相似[2]，因此逐渐在神经系统疾病的研究中被广泛应用。在我们利用RV载体构建疾病细胞模型研究中的研究中，通过观察及检测构建的EGFP-RV病毒载体对SK-N-SH细胞株的感染及表达的效率，为下一步的实验提供重要的实验数据。1材料与方法1.

4、1试剂pLXSN质粒购自美国Clontech公司；pBV220/EGFP由华广生物技术公司提供；脂质体2000购自Invetrogen公司；EcoRI、BamHI核酸内切酶、T4DNA连接酶、G418、Polybrene购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司。1.2细胞株SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株购自中科院上海细胞库；HEK293反转录病毒包装细胞系、NIH3T3细胞由华广生物技术公司提供。1.3构建pLXSN/APP695.sw重组质粒扩增pBV220/EGFP质粒，使用EcoRI和BamHI双酶切；将pLXSN载体质粒使用EcoRI和BamHI双酶切，分别回

5、收目的基因片段EGFP和线性化载体pLXSN。将回收的目的片段和载体使用T4DNA连接酶进行连接，16℃，16h。连接产物转感受态细菌，挑取X-gal固体平板上的白色单个转化菌落扩增。小量提取质粒并使用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，质粒测序正确后进行扩增和大量制备。1.4表达EGFP的重组病毒的包装复苏HEK293反转录病毒包装细胞系[3],分组加入不同浓度筛选抗生素G418的选择培养基，两周后，确定G418筛选剂量（为400mg/L）。将1本课题得到国家自然科学基金项目（30400515,30300395）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金项 目（20030698011）和陕西省自

6、然科学基金项目（2001SM57）的资助。-1-http://www.paper.edu.cnHEK293传代，80％成片时使用脂质体进行pLXSN/EGFP质粒转染，转染6-8h当细胞的立体感和界限模糊时终止转染，换用完全培养基培养，待细胞状态恢复后，换用400mg/L的G418选择培养基。两周后未转化细胞已经全部死亡，转化细胞已经生长出细胞克隆。分别挑选出生长旺盛的10个克隆小心移植到24孔培养板中，G418继续生长筛查，当细胞生长成片到100％后，收集上清滴定病毒，产生高滴度病毒的细胞克隆进行扩大培养。1.5计算病毒滴度在20mL的完全培养基中加入10mg/L的Polybrene，使用

7、该液体系列稀释被滴定的病毒原液，从10－1-10－8系列稀释。用稀释后的病毒液转染80％成片的NIH3T3细胞，转染48h后用荧光显微镜观察荧光，寻找有荧光的细胞克隆小于10个的稀释浓度，计算病毒滴度。病毒滴度使用cfu/mL表示。集落形成单位（colonyformingunits，cfu）=筛选后形成的细胞集落数×转染时的稀释倍数。1.6确定重组RV对SK-N-SH细胞株的感染效率复苏SK-N-SH细胞株，