腺病毒介导的rna干扰降低vegf及其受体kdr，flt转录抑制血管形成的研究

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1、南京师范大学硕士学位论文腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF及其受体KDR，FLT转录抑制血管形成的研究姓名：许剑锋申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：李朝军20070527堡主兰垡笙苎堕塑兰坌量塑!盟垒王垫壁堡婴竺墨基塞堡鉴坠：坠鲎茎塑塑坐笪登堕墼!墨果。学位论文独创性声明本人郑重声明：1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、

2、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意．作者签名：日期：学位论文使用授权声明本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者签名：日期：2硕士学位论文臆病毒介导的RNA干扰降低VEGF及其受体KDR，FLT转录抑制血管形成的研究中文摘要血管新生对于肿瘤的生长、

3、浸润和转移过程是十分重要的。肿瘤依靠新生血管来提供营养(包括氧气)和排泄废物，转移灶的形成和发展也依赖于新生血管的形成。临床研究显示，肿瘤诱导血管新生的能力决定了其生长和转移的能力。如能有效抑制血管生成、切断肿瘤血供，有望达到抑制肿瘤生长、发展和转移的目的。绝大多数恶性肿瘤中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR)均呈高表达，形成旁／自分泌作用方式，促进内皮细胞分裂、增殖，诱导血管新生，并直接作用于肿瘤细胞刺激其生长。VEGF：i!E--些恶性肿瘤(包括

4、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和脑癌等)中表达水平显著增高，并与肿瘤的微血管密度、恶性程度以及转移密切相关。我们因而设想下调VEGF和VEGFR表达可能会抑制血管形成，进而减缓肿瘤的生长和浸润。RNA干扰(RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的抑制基因表达技术。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被广泛用于基因治疗和临床试验中，所以本研究采用了腺病毒介导的RNAi技术来验证我们的设想。结果如下：1．我们用细菌内同源重组的方法构建了针对VEGF，VEGFR的SiRNA表达重组腺病毒Ad

5、Hl一siRNA／VEGF，AdHl一siRNA／KDR，AdHI—siRNA／FLT，Real—timeRT—PCR实验表明，AdHI—siRNA／VEGF，AdHl一siRNA／KDR，AdHl一siRNA／FLT可特异性地使血管内皮细胞(删VEc)中的VEGF，KDR，FLTmRNA量下降。其中，与对照组相比，AdHl一siRNA／vEGF干扰后，VEGF的mRNA量下降为50％，而AdHl一siRNA／KDR干扰后，KDR的mRNA量下降为52％，AdHI—siRNA／FLT干扰后，FLT的mRNA量下降为40％。2，三种干扰病毒Ad

6、Hl一siRN月I／VEGF，AdHI—siRNA／KDR，AdHI—siRNA／FLT对HUVEC细胞增殖有干扰作用，以AdHl～siRNA／FLT最强。加入病毒9天后，对照组的细胞平均计数为31．5×104／pl，空载病毒干扰组为28×104／ul，AdHI—siRNA／VEGF干扰组为21．5×104／lal，AdHI—siRNA／KDR干扰组为21×104／lJl，AdHl一siRNA／FLT干扰组为16．25X104／ul。3．三种干扰病毒AdHl一siRNA／VEGF，AdHl一siRNA／KDR，AdHI—siRNA／FLT对H

7、UVEC细胞在Matrigel上形成微血管均有干扰作用，对照组每HPF形成微血管数量为10．75条。4硕士学位论文腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF及其受体KDR，FLT转录抑制血管形成的研究空载病毒干扰组为10．25条，实验组以AdHl一siRNA／VEGF干扰作用最弱，每HPF形成微血管数量为7条，AdHl一siRNA／KDR次之，每HPF形成微血管数量为6条，其中以^dHl一siRNA／FLT作用最强，每HPF形成微血管数量为1—2条，视野中大部分细胞均不能形成微血管，而形成大面积空斑。关键词：血管生成，血管内皮生长因子及受体，RNA干

8、扰，硕士学位论文腺嫡毒介导的RNA干扰降低VEGF及其受体KDR，FLT转录抑制血管形成的研究AbstractAngiogenesis，theformationof