荷载ki67小干扰rna条件增殖腺病毒介导肾癌靶向治疗的研究

《荷载ki67小干扰rna条件增殖腺病毒介导肾癌靶向治疗的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、天津医科大学博士论文siRNAsmallinterferingRNA符号说明小干扰RNARNAiRNAinterferenceRNA干扰shRNAsmallhairpinRNA小发夹RNACRAdsconditionallyreplicativeadenovirus条件增殖型腺病毒dsIⅢAdoublestrandRNA双链RNAFCSfetalcalfserum胎牛血清RT-PCRreversetranseript-polymerasechainrecation逆转录一聚合酶链反应MTT3_4．5一dimethylthiazolzyl-

2、diphenyltetrazoliumbromide四甲基偶氮唑蓝TUNELinstiuendIdlingtechnique原位末端缺口标记法NBTnitrobluetetrazoliumchl谢dc氮兰四唑BCIP5一bromo-4一chloro-3-indolylphosphate5-嗅-4·氯一3吲哚磷酸O．DopticaIdensity光密度APalkalinephosphata∞硷性磷酸酶PFUplaqueformationunit空斑形成单位MOImultiplicityofinfection感染复数CPECytopathic

3、effect细胞病变效应2天津医科大学博士论文学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文版权使用授权书本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门

4、或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√”)2年月日天津医科大学博士论文荷载Ki67小干扰RNA的条件增殖腺病毒介导的肾癌靶向治疗的研究博士生郑骏年导师马腾骧教授中文摘要背景：肾癌确诊时30％一40％已有转移，5年生存率不足10％。其对化疗、放疗、免疫治疗均不敏感，因此迫切需要寻找新的治疗方法。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，它是将与靶基因同源的小片段双链RNA(smallinterferingRNAs，

5、siRNA)转染靶细胞，从而特异性降解靶基因mRNA，RNAi有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。但基因治疗方案至今没有取得实质上的突破，使得基因一病毒治疗应运而生。基因一病毒治疗是让条件增殖腺病毒(Conditionallyreplicativeadenovirus，CRAds)携带治疗基因，利用CRAds的特异性增殖能力，使治疗基因在肿瘤细胞内成千上万倍的增加，同时CRAds本身也有肿瘤杀伤作用。构建CRAds的方法之一是将腺病毒在正常细胞中复制必需，而在肿瘤细胞中复制不需要的基因如E1B55Kda蛋白基因删除。目前携带siRNA的CRA

6、ds治疗肿瘤研究仅有几篇报道，其中用于肾癌的研究尚未见报道，本研究将针对肿瘤增殖基园Ki67的siRNA插入CRAds构建ZD-Ki67，体外及动物实验研究其对肾癌的靶向治疗作用。第一部分Ki67siRNA有效序列的确定，表达载体的构建及其对肾癌的治疗作用合成针对Ki67cDNA364～382碱基的Ki67-siRNA，将Ki67-siRNA(100nmol／L)转染人肾癌786-0细胞。采用RT-PCR、Westernblot、免疫细胞化学技术检测不同水平的Ki67表达，MTT法检测细胞增殖，免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果发现，

7、Ki67-siRNA处理组786-0细胞Ki67表达降低，细胞天律医科大学博士论文增殖抑制率增加，凋亡细胞阳性率增加。结果表明我们筛选的Ki67-siRNA能抑制肾癌细胞Ki67基因表达，进而抑制其增殖，促进其凋亡。根据确定的序列，构建Ki67一siRNA表达质粒，并研究其对人肾癌细胞Ki67基因表达及生长的抑制作用。设计有小发夹机构的二条Ki67一siRNA对应模板DNA序列，煺火处理后克隆至pSilencer3．1质粒，构建重组质粒pSilencer—Ki67。酶切及测序证实后将pSilencer—Ki67转染人肾癌786-0细胞及荷

8、786—0裸鼠，结果发现pSilencer—Ki67可显著抑制786—0细胞及移植瘤组织Ki67表达，进而抑制其增殖、促迸其凋亡。为我们构建携带Ki67一siRNA的CRAds打下基础。第二部