ki67启动子调控的荷载双基因rna干扰的条件增殖腺病毒靶向治疗肾癌体外实验研究

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1、徐州医学院硕士学位论文Ki67启动子调控的荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒靶向治疗肾癌体外实验研究姓名：李静申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：郑骏年2012-03徐州医学院硕士学位论文Ki67启动子调控的荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒靶向治疗肾癌体外实验研究中文摘要目的研究Ⅺ67启动子调控的荷载飚67．siRNA、hTERlT-siRNA及飚67．siRNA+hTEImsiI斟A(double．siIⅢA)的条件增殖型腺病毒对肾癌的体外治疗效果。方法飚67．ZD55、飚67．ZD55．Ⅺ67．siRNA、飚67．ZD55．hTER

2、_T-siIⅢA、瞄67．ZD55．double．siRNA腺病毒大量扩增后测定滴度；将上述四种腺病毒分别感染肾癌KETR-3、786．O、AcHN细胞及正常HK-2细胞，westenlBlot检测腺病毒E1A蛋白在细胞中的表达情况；TCD50检测腺病毒在细胞中的复制能力；ImPCR检测腺病毒对细胞中尉67基因、hTEI汀基因的沉默效果；免疫细胞化学检测腺病毒对细胞中瞄67蛋白及hTEI盯蛋白表达的抑制情况；CCK-8法检测腺病毒对细胞增殖的影响；AnneXiIlV-FITC／PI法检测腺病毒对细胞凋亡的影响；结晶紫染色检测腺病毒的细胞毒性作用。

3、结果1．在肾癌KETR．3、786．O、ACHN细胞中，四组病毒均表达E1A蛋白，同一细胞中飚67．ZD55．double．siIⅢA组E1A蛋白表达量较鼬67．ZD55组、飚67．ZD55．鼬67．siIⅢA组及飚67．ZD55．hTER-T-siRNA组E1A蛋白表达量多，P<0．05，差异有统计学意义，其病毒复制能力也最强，Ⅺ67．ZD55．飚67．siRNA组及飚67．ZD55．hTEImsiRNA组E1A蛋白表达量较硒67．ZD55组ElA蛋白表达量多，P<0．05，差异有统计学意义，飚67．ZD55的病毒复制能力也最弱，而鼬67．ZD

4、55．Ⅺ67．siIⅢA组及飚67．ZD55．hTERT-siIⅢA组E1A蛋白表达量无差异(P>O．05)；在KETR．3、786．o、ACHN细胞中四种病毒E1A蛋白表达量是逐渐降低的，四种病毒在KETR．3细胞中显示最强的复制能力，在786．O细胞中其次，在ACHN细胞中最弱；在HK．2细胞中未检测到E1A蛋白的表达，四种病毒也无徐州医学院硕士学位论文复制能力。2．ImPCR检测结果与免疫细胞化学结果显示在肾癌KETR．3、786．O、ACHN细胞中，飚67．ZD55．double．siIⅢA组及鼬67．ZD55．Ⅺ67．siIⅢA组的Ⅺ6

5、7mIⅢA的表达和蛋白的表达均明显降低，与其它组和对照组相比差异有统计学意义(尸<0．05)；Ⅺ67．ZD55．double．siRNA组及硒67．ZD55．hTERl乙siIⅢA组的hTEI盯IIl】赋A的表达和蛋白的表达均明显降低与其他组和对照组相比差异有统计学意义(尸O．05)。3．CCK-8法、结晶紫染色法及A皿exinV-FITC／PI法显示四种

6、病毒对肾癌KETR．3、786．O、AcHN细胞均有杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用，且CCK_8法显示病毒对细胞增殖的抑制作用与病毒的浓度及感染时间存在正相关性，其中飚67-ZD55．double-siRNA组对肾癌细胞的杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用最强，尸<0．05，差异有统计学意义；瞄67．zD55．瞄67．siIⅢA组及瞄67一ZD55．hTER-T-siRNA组作用其次，两组间无差异(P>O．05)；飚67一ZD55组对肾癌细胞的杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用最弱，P

7、腺病毒在KETR．3细胞中作用最明显，在786．O细胞中作用其次，在ACHN细胞中作用较弱；四种病毒对HK．2细胞均无明显杀伤作用、增殖抑制作用作用和诱导细胞凋亡的作用。结论成功构建的携带飚67启动子、飚67．siRNA及hTER-T．siRNA的条件增殖型腺病毒飚67．ZD55、飚67．ZD55．飚67．siRNA、飚67．ZD55．hTER．T．siIⅢA、Ⅺ67．ZD55．double-siIⅢA可在表达Ⅺ67的肾癌细胞内大量扩增，除了发挥自身的溶瘤作用外，还可高效表达飚67．siRNA、hTEImsiRNA，从而进一步增强了其抑制肾癌细胞

8、增殖、促进肾癌细胞凋亡的作用；携带飚67启动子上述腺病毒，表现出更强的靶向性和生物学活性。本研究为肿瘤的生物治疗提供了一个新的思路，为本