cpgodn对支气哮喘小鼠气道炎症及黏液形成的影响

《cpgodn对支气哮喘小鼠气道炎症及黏液形成的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

优秀毕业论文广东医学院硕士学位论文CpG-ODN对支气哮喘小鼠气道炎症及黏液形成的影响姓名：贾明雅申请学位级别：硕士专业：@指导教师：吴斌201005精品参考文献资料 优秀毕业论文CpG．ODN对支气管哮喘小鼠气道炎症及黏液形成的影响中文摘要【目的】本实验通过观察CpG—ODN对哮喘小鼠Thl厂rh2细胞因子、气道杯状细胞、肺组织MUC5ACmRNA及MUC5AC表达水平的影响，探讨CpG．ODN抑制支气管哮喘小鼠气道炎症以及黏液形成的机制和作用，为其对哮喘的防治提供理论依据。【方法】按随机数字表将30只昆明雌性小鼠随机分为3组，N组为正常对照组、A组为哮喘模型组、C组为CpG．ODN治疗组，每组10只小鼠。正常对照组：用生理盐水代替卵清蛋白(OVA)进行小鼠腹腔注射和雾化吸入；哮喘组以OvA致敏激发小鼠；CpG．ODN治疗组于激发前l小时给予腹腔注射干预。所有小鼠在最后一次激发24h后被处死采集标本，计数肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数和嗜酸性粒细胞(Eos)数目，苏木素一伊红(HE)染色和阿利新蓝．过碘雪夫染色(AB．PAS)观察小鼠肺组织病理形态学改变，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白介素-4(IL．4)和丫一干扰素(IFN．Y)表达水平，以逆转录．聚合酶联反应(RT-PCR)法和免疫组织化学法(IH)分别观察小鼠肺组织中MUC5ACmRNA含量及黏蛋白MUC5AC的表达水平。所得数据均用统计学软件SPSSl3．0进行统计分析。【结果】1小鼠气道、肺组织炎症的变化脏染色显示：正常对照组小鼠支气管管壁及其周围肺组织结构完整，未见或偶见少量炎性细胞浸润，无明显炎性渗出；哮喘组小鼠支气管壁及其周围组织和肺泡可见以中性粒细胞为主的大量炎性细胞浸润，气道上皮杯状细胞明显增多，部分支气管上皮细胞损伤脱落，支气管腔内分泌物增多；CpG．ODN治疗组支气管壁及其周围组织和肺泡炎性细胞浸润明显减轻，上皮结构基本完整。AB．PAS染色显示：三组小鼠气道均有不同程度的黏蛋白表达，哮喘组小鼠气道上皮杯状细胞增生明显，管腔内可见大量黏液分泌，AB．PAS染色胞浆呈紫精品参考文献资料 优秀毕业论文红色；CpG．ODN干预组小鼠气道上皮杯状细胞增生减轻，粘液分泌减少，经统计学分析，差异有统计学意义(尸1000kD，具有黏着性和伸缩性，其基因位于11P15染色体上，目前己经克隆出12种黏液基因，正常人和哮喘患者气道中最主要黏蛋白基因是MUC5AC【221，哮喘患者的MUC5AC的表达较正常人高60％，因而被认为是气道杯状细胞化生(GCH)的“标志物，’【231，可能还有MUC5B、MUC2参与。哮喘时气道黏蛋白分泌异常的机制：(1)黏蛋白基因的过度表达；(2)黏液分泌细胞的增生、肥大、化生；(3)黏液分泌细胞黏蛋白的过度分泌(脱颗粒)。精品参考文献资料 优秀毕业论文目前比较一致的观点是哮喘中黏蛋白基因表达上调，杯状细胞数目增加，贮存和分泌的黏蛋白增加，导致痰液分泌增加、气道狭窄而病情加重。Tll2胁1细胞失衡是哮喘发病的一个重要机制，关于哮喘中黏蛋白基因以及杯状细胞表达调控的研究目前多集中于Tll2细胞因子，研究表明白细胞介素．4(IL．4)、IL．9和IL．13等，均能诱导和促进哮喘黏液的形成与分泌【24'251。Dabba曲K【26】等研究发现，IL．4无论体内和体外都可直接诱导支气管上皮细胞MUC2和MUC5AC黏蛋白基因表达上调，并可促进杯状细胞增生，对黏液蛋白的产生起着重要作用，其机制可能是IL．4与IL．4a结合，活化信号转导通路JaIlus激酶(JAKs)、信号转导与激活因子6(sigIlaltraIlsducerandactivatorof缸．觚scription6，STAT6)及其他信号分子，促进MUC5AC转录。Dabba曲K等【261研究进一步发现，Th2型细胞因子如IL．4、IL．5特别是IL．4是直接诱导气道上皮细胞分化为能分泌黏液的杯状细胞的关键因子。所以通过阻断IL_4传导通路可抑制黏液蛋白的合成。同时，也有研究认为，表皮生长因子受体(EGFR)及其配体【27，28】以及“钙激活的氯通道，’(鼠为Cob．5，人为hCLCAl)【29】在哮喘的GCH／M中起重要作用。鉴于此，本研究通过检测CpG．ODN对哮喘小鼠n11厂T112细胞因子、气道杯状细胞和肺组织MUC5ACmRNA及其蛋白表达水平的影响，探讨其抑制哮喘的气道炎症、粘液形成以及影响粘液形成的机制。进一步阐明哮喘发病机理以及CpG．ODN作用机制，为CpG．0DN治疗哮喘时提供理论依据。1．3研究目的本实验通过观察CpG．ODN对哮喘小鼠气道炎症、IL．4、IFN．Y细胞因子、气道杯状细胞表达、肺组织中MUC5AC酬盼怆含及黏蛋白MUC5AC表达的影响，探讨CpG．ODN治疗哮喘黏液蛋白机制和效果，为CpG．ODN用于哮喘的临床治疗提供理论依据1．4研究内容(1)正常对照组、哮喘组和CpG．ODN治疗组小鼠的制备；(2)各小组小鼠肺组织的病理变化；(3)各小组小鼠BALF中自细胞总数、Eos计数、IL．4、IFN吖水平的变化，各小组小鼠气道杯状细胞表达、肺组织中MUC5ACIIl】[斟A含及黏蛋白MUC5AC表达的变化；8精品参考文献资料 优秀毕业论文(4)小鼠BALF中E0s和IL．4水平的关系；(5)小鼠肺组织中黏蛋白MUC5AC与BALF中IL．4水平的关系；(6)小鼠肺组织中黏蛋白MUC5AC与BALF中Eos数量水平的关系。9精品参考文献资料 优秀毕业论文2材料和方法2．1材料2．1．1实验对象：30只清洁级昆明雌性小鼠，6．8周龄，体重20士29，购自广东医学院实验动物中心。2．2主要实验器材超声雾化器(JSC．202)辽宁鞍山电子医疗仪器厂DNA扩增仪Eppendorf德国可调式微量移液器法国Gilson公司电泳仪、水平电泳槽美国Bio．I硼公司烤箱BHP一9162型紫外透射仪美国PerkjnElmer公司752紫外分光光度计日本SHIMADZUUVminil240格兰仕X型微波炉格兰社公司Model550型自动酶标仪BIO．Rad公司，日本电冰箱西门子公司德国超低温冰箱海尔超净工作台北京昌平长城空气净化工程公司高速低温台式离心机德国Eppendorf公司电子天平BS．200S型德国Sanorius公司切片机AS620E英国SHANDON公司光学显微镜日本OnTUS公司凝胶成像及分析系统砧phal彻【oteCh公司，美国ABI7300全自动荧光定量PCR仪美国Perk．mElmer公司2．3主要试剂SP试剂盒武汉BOSTER公司兔抗小鼠MUC5AC多克隆抗体北京博奥森公司浓缩型DAB显色试剂盒武汉BOSTER公司二步法免疫组化检测试剂武汉BOSTER公司30％过氧化氢Sigma公司lO精品参考文献资料 优秀毕业论文小鼠IL．4ELISA试剂盒武汉BOSTER公司小鼠IFN．YELISA武汉BOSTER公司Mayer苏木素武汉BOSTER公司PBS(0．1M，O．5M)武汉BOSTER公司Trizol液大连宝生物工程有限公司RTPCR试剂盒大连宝生物工程有限公司DNAmarkerDL．1200大连宝生物工程有限公司琼脂糖大连宝生物工程有限公司TEbu脓、O．5MEDTA、嘶s大连宝生物工程有限公司10％SDS、硼酸大连宝生物工程有限公司异丙醇广州化学试剂厂PCR引物上海生物工程有限公司CpG-ODN(1826)上海生物工程有限公司B．actin内参上海生物工程有限公司瑞氏．吉姆萨染液广东医学院附属医院肾病研究所戊巴比妥钠湛江市霞山东泰试剂仪器公司鸡卵清蛋白OVASigma公司，美国2．4主要试剂配制①多聚赖氨酸的配制配法：多聚赖氨酸1份，蒸馏水9份，混匀备用。②10％中性福尔马林固定液的配制配法：40％甲醛100111l，NaH2P04．2H2049，Na2HP04．12H206．59，加蒸馏水至1000ml，混匀备用。③l％盐酸酒精的配制配法：浓盐酸5ml，75％酒精500IIll，混匀备用。④1％氨水的配制配法：浓氨水5“，75％酒精500础，混匀备用。⑤六胺银工作液的配制配法：容器要求干净，先加3％六次甲基四胺25IIll于量筒内，再加3％硝酸银精品参考文献资料 优秀毕业论文溶液3“，出现白色混浊后摇匀，使溶液变透明，再加入5％硼酸2ml，再混匀备用。⑥l％过碘酸的配制配法：过碘酸19，加蒸馏水至100ml，混匀。⑦5％硫代硫酸钠的配制配法：硫代硫酸钠59，加蒸馏水至100m1，混匀。⑧0．OlM磷酸盐缓冲液(phosptatbu艉rsolutions，PBs)(pH7．2～7．4)的配制配法：NaCl8．59，Na2HP04．12H203．59，NaH2P04．2H20O．259，加蒸馏水至1000ml，混匀。⑨o．olM枸橼酸盐缓冲液(pH6．o)的配制配法：枸橼酸钠(C6H5Na307．2H20)39，枸橼酸(C6H807．H20)0．49，加蒸馏水至looOml，混匀。⑩3％双氧水的配制配法：30％双氧水10rnl，蒸馏水90ml，混匀备用。o白细胞计数液(100m1)2％冰醋酸(即2ml冰醋酸加入98mlddH20)加入2-3滴龙胆紫2．5实验方法：2．5．1小鼠哮喘模型的建立①动物分组：30只清洁级昆明雌性小鼠(购自广东医学院实验动物中心)6．8周龄，体重20士29，随机【301分为正常对照组、哮喘组和CpG．ODN治疗组3组，每组10只。②哮喘模型组建立【31】：每只小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射OvA抗原液0．2“(含OvA10pg和氢氧化铝3mg)致敏，第26、27、28、29、30天将小鼠置于自制的箱内使其雾化吸入l％OVA抗原液激发，每天1次，每次1小时，共5d。正常对照组：用生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。③cpG．ODN治疗组：哮喘小鼠动物模型的建立同哮喘，在第26、27、28、29、30天激发前u1分别腹腔注射生理盐水混合液lIIll(CpG—ODN100pg／只)。哮喘组和正常组对照组仅用生理盐水腹腔注射。2．5．2标本的获得及处理12精品参考文献资料 优秀毕业论文①在最后一次激发24h后，用3％戊巴比妥钠0．6ml腹腔麻醉，眼球放血致死，暴露气管，用22G静脉穿刺针插入气管内，拔出针芯，固定，用PBsO．6ml灌洗双肺，每次气道内注入、回抽3次，然后回收灌洗液，重复3次，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)于5mlEP管中。然后在无菌条件下开胸，完整地分离心肺组织，迅速取下左肺组织置于冻融管(液氮中)，然后于．70℃冰箱保存。用于I矾A抽提，然后应用逆转录PCR测定MuC5AC(mI斟A)表达的变化。取右肺中叶置于10％福尔马林固定24h，常规制备病理切片，HE染色及做MUC5AC免疫组化后观察肺组织病理变化和黏液蛋白基因的表达，行阿尔辛蓝一雪夫氏(AB．PAS)染色，观察杯状细胞化生指数(指每毫米气管上皮中杯状细胞数目)，此指标作为气道黏液的定量观察指标。②BALF细胞总数和Eos％的检测收集的BAIF4℃2000r／min离心10min，收集上清．．80℃冻存待测细胞因子。细胞用1IlllPBS液重悬，取0．1ml于血细胞计数台行细胞总数。取0．2ml涂片，瑞吉染液染色，Eos细胞浆特异染成橘红色，至少计数200个细胞作细胞分类。再根据百分比计算出Eos数目。2．5．3实验步骤(1)HE染色具体操作步骤1)染色前切片脱蜡水化，依次如下：①二甲苯I、II各15min；②100％酒精10sec：③95％酒精lOsec；④自来水洗3次；2)染色，依次如下：①苏木精染液15min：②自来水洗3次；③1％盐酸酒精分化20sec；④自来水洗3次；⑤1％氨水返蓝20sec；⑥自来水洗3次；精品参考文献资料 优秀毕业论文⑦伊红水溶染液l～3min；⑧自来水洗3次：3)脱水、透明、封固，依次如下：①95％酒精2sec；②100％酒精2sec；③60℃烤箱烤干(15min)；④二甲苯2sec：⑤烤干、中性树胶封固。(2)AB．PAS染色①切片脱蜡至水②滴入阿利新蓝染色液染色5min，流水冲洗至无染料脱落。③滴入高碘酸染色5min，蒸馏水洗。④流水冲洗10min。⑤80％酒精(10min)一95％酒精(10min)一无水酒精(10min×2)一55～60℃烤箱(20min)一二甲苯透明(10min×2)一55～60℃烤箱(20min)_中性树胶封片。⑥检验结果：酸性黏液物质呈蓝色，糖原、中性黏液物质呈红色，混合黏液呈紫色AB．PAS其评分具体方法参照文献【321。气道上皮杯状细胞增生评分标准规定如下：每lmm长气管上皮中杯状细胞数目：O，没有杯状细胞；l，Q5％上皮；2，25％．50％上皮；3，50‰75％上皮；4，75％上皮。每只小鼠至少计算5个气道，所有上皮细胞积分取平均值。(3)免疫组化1)主要技术链霉亲合素一过氧化物酶(SP)免疫组化法2)主要步骤①标本经lO％中性缓冲福尔马林液固定、脱水，石蜡包埋，切片厚4～5岬，载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片。②石蜡切片脱蜡和水化：将切片从烤箱取出室温下放置15111in，入二甲苯(15miIl×2)一无水酒精(10I如×2)一95％酒精(5miIl×2)_80％酒精(5mill)14精品参考文献资料 优秀毕业论文一蒸馏水(2min×2)；③高压修复抗原：将装有0．01M枸橼酸盐缓冲液的烧杯置入高压锅中，加热至沸腾(温度>95℃)，然后放入切片，加压至喷气2min，置流水下冷却减压，待高压锅的小阀门下降后打开盖子，自然冷却至室温(30min)_O．01MPBS洗(2min×3次)；④灭活内源性过氧化物酶：放入新鲜配置的3％H202中，室温30mifl(避光)，PBS冲洗2min×3次；⑤滴加一抗：滴加适当比例稀释的一抗即抗MUC5AC抗体工作液(工作浓度分别为1：150)，湿盒内4℃孵育过夜。⑥室温复温45min，O．OlMPBS冲洗(5min×3次)；⑦滴加二抗：滴加非生物素PV-6002，室温孵育40min，PBS洗(5min×3次)；⑧DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各l滴，均混后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间(3～5min)，染色结果阳性指标为棕黄色，具体在显微镜下根据颜色的变化，掌握染色时间，蒸馏水冲洗终止显色；⑨苏木素复染2min，1％盐酸酒精分化ls，自来水冲洗3mi吐氨水返蓝10min：⑩梯度酒精脱水、封片：80％酒精(10min)_95％酒精(10min)_÷无水酒精(10minx2)_55～60℃烤箱(20min)_二甲苯透明(10min×2)一55～60℃烤箱(20min)_中性树胶封片。@每次实验设空白对照实验(用PBS代替一抗，余操作步骤同上)及阳性对照(已知阳性的标本，步骤同上)。4．2染色结果的判断和分析阳染细胞可呈棕黄色、黄色、淡黄色。高倍镜下黏蛋白MUC5AC主要为胞浆显色，细胞膜可有阳性反应，但以胞浆为主。应用电脑图像采图软件SpotAdvanced及以IIIlage．ProPlus分析软件(美国MediaCybemetics公司)进行图像分析，每张切片在400倍视野下随机采集5个包含气管或肺内小气道的视野，测定每个视野下气管或肺内小气道阳性表达的积分光密度(IntcgratedOptic“DeIlsi饥精品参考文献资料 优秀毕业论文lOD)，然后计算每只小鼠气管或肺内小气道IOD的平均值，再根据每只小鼠的IOD平均值计算出每组小鼠的IOD平均值，IOD值的大小即反映MUC5AC阳性目标的总强度，根据IOD值进行统计分析，10D值越大，表示表达量越多。(4)逆转录(RT)．PCR1)主要技术逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetraIlscription．PCR，RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。引物设计和合成目的基因和内参的引物参考相关文献【33·341，并经过基因库查询校对核实在交付上海生物工程有限公司合成，序列如下：检测指标引物序列产物长度MUC5AC上游引物CAGCCGAGAGGAGGGTTTGATCT399bp下游引物AGTCTCTCTCCGCTCCTCTCAATp．∞tin上游引物CCTCATGAAGATCCTGACCG20lbp—F游引物ACCGCTCATTGCCGATAGTG2)主要步骤2．1组织IⅢA的提取组织块置匀浆器，加Trizollml，冷冻匀浆，转置于1．5mlEppendollF管，室温静置5min，加入氯仿O．2ml，盖紧盖子，用力摇动15s，再室温静置5min，4℃12000L／min离心15min，取上清液至新的1．5mlEppendorf管，加与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15．30℃下静10miIl，4℃12000r／min离心10IIlin，弃上清液，75％乙醇(含DEPC)洗涤沉淀一次(至少lml75％乙醇枷TRJz01)，4℃12000r／IniIl离心5min，弃乙醇，空气或真空干燥5．10mill(不要完全干燥)，加DEPC处理水溶解I斟A，．80℃保存备用。2．2RNA样品鉴定浓度计算：每样品在紫外分光光度计上测定波长为260咖时的吸光度值。浓度计算公式：浓度(g／L)=OD2印×稀释倍数×40／1000。2．3逆转录反应取3此A模板做逆转录反应，反应体系如下：①dNl．PMiXn鹏(10mMeach)l此16精品参考文献资料 优秀毕业论文OligodTprimer(2．5UM)1斗LI斟A模板3此RNaseFreedH205“L总体积：10此②PCR仪上进行变性、退火反应：65℃5min，然后4℃。③上述变性、退火后反应液10皿5×逆转录bu虢r4此RNaseIllllibitor(40U／止)O．5pLPrimeScripiTMItNase0．5斗LRNaseFreedH205“L总体积：20此④PCR仪上按下列条件进行反转录反应：45℃20min95℃5min4℃⑤贮存于．20℃备用。．“2．4PCR反应①按以下反应体系进行：lO×PCRbu腩r5肛LdNTPMixture(10IIlMeach)2此上游弓l物(20pM／pL)0．5pL下游引物(20pM／此)O．5皿讯如ExTaq俐HS(5U／此)O．5灿上述反转录反应液4pLRNaseFreedH2037．5pL总体积：50此②反应条件为：MUC5AC94℃预变性5m毗94℃lmin变性，52℃，(MUC5AC)或57℃lmill(p-actin)退火，45s，72℃lmin延伸，共进行33个循17精品参考文献资料 优秀毕业论文环，72℃5miIl延伸。③扩增产物经1％琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，凝胶成像系统(美国，U、，P公司)摄取图像并分析条带的吸光度值，以肌动蛋白的条带作为内参，获得相对荧光度值。(5)ELISA法测定BALF中IL-4及IFN吖含量严格按试剂盒说明书操作，具体步骤如下：5．1小鼠BALF中IL．4的检狈0：①实验前30min将所有的试剂和标本取出恢复至室温；②依次在酶标板反应孔内加入100肛1标准品(0p∥ml、7．8pg／ml、15．6pg／ml、31．3pg／ml、62．5pg／ml、125pg／ml、250pg／m1)和待测样本；⑨用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育反应60min；④弃去反应孔内液体，用三蒸水稀释了20倍的洗涤液注满各孔，甩干，反复清洗5次后拍干；⑤各孔内分别加入O．1ml抗体工作液，温和混合15sec，37℃孵育反应60min：⑥弃去反应孔内液体，用O．01MPBS洗涤3次，每次浸泡lmin左右⑦每孔加入已准备好的亲和素-过氧化物酶复合物(ABc)工作液各100pl，37℃孵育30min；⑧弃去反应孔内液体，用0．01MPBS洗涤3次，每次浸泡2min左右每孔中加90ulTMB显色液，37℃避光孵育20戚n；⑨每孔分别加入O．1mlTMB终止液，可见蓝色梯度出现。⑩在20miIl内用酶标仪在450衄波长测0D值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算检测物的浓度。5．2小鼠BALF中IFN吖的检测：①实验前30miIl将所有的试剂和标本取出恢复至室温；②依次在酶标板反应孔内加入100pl标准品(Op咖l、7．8pg枷、15．6pg／“、31．3pg／“、62．5pg枷、125pg枷、250pg／m1)和待测样本；③用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育反应60IIlill；精品参考文献资料 优秀毕业论文④弃去反应孔内液体，用三蒸水稀释了20倍的洗涤液注满各孔，甩干，反复清洗5次后拍干；⑤各孔内分别加入0．1ml抗体工作液，温和混合15sec，37℃孵育反应●60min：⑥弃去反应孔内液体，用0．01MPBS洗涤3次，每次浸泡1min左右⑦每孔加入已准备好的亲和素一过氧化物酶复合物(ABc)工作液各100pl，37℃孵育30min：⑧弃去反应孔内液体，用O．01MPBS洗涤3次，每次浸泡2min左右每孔中加90ulTMB显色液，37℃避光孵育20min；⑨每孔分别加入0．1mlTMB终止液，可见蓝色梯度出现。⑩在20min内用酶标仪在450姗波长测OD值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算检测物的浓度(6)分析方法使用SPSSl3．O统计软件进行统计分析。实验数据用i士J表示。多个样本均数的比较采用单因素方差分析(011e_W毋ANOVA)，多个样本均数间每两个均数的比较用方差齐性检验(Homogeneit)，．00vauriaIlce)，当总体方差齐时，选择Bonfell．oni法；当方差不齐时，选择Tamhane’sT2法。尸≮O．05表示差异有统计学意义。19精品参考文献资料 优秀毕业论文3结果3．1小鼠哮喘模型的建立小鼠经OVA致敏并激发后表现为呼吸急促、烦躁不安、大小便失禁、点头样喘息、腹肌痉挛等症状。病理切片显示，气道黏膜水肿，上皮细胞脱落，肺组织出现Eos、中性粒细胞、淋巴细胞等大量炎症细胞浸润以及杯状细胞增多。符合哮喘的病理改变，说明哮喘模型制备成功。3．2小鼠肺组织病理学改变3．2．1小鼠肺组织HE染色正常对照组小鼠支气管肺组织病理切片镜下可见支气管管壁及其周围结构完整、清晰，未见或偶见少量炎性细胞，管腔内无明显渗出：哮喘组可见支气管壁及其周围组织和肺泡有以中性粒细胞为主的大量炎性细胞浸润，气道上皮杯状细胞增多，有部分支气管上皮细胞损伤脱落，支气管腔内分泌物增多；CpG．0DN治疗组支气管壁及其周围组织炎性细胞浸润较哮喘组明显降低，上皮基本完整。(见图1～图6)图l正常对照组小鼠肺组织病理切片(HElOO×)FiglThelungtissuefhmcontrolgmup(眦100×)精品参考文献资料 优秀毕业论文图2哮喘组小鼠肺组织病理切片(HE100×)Fig2Thelungtissueflromasthmaticgroup(HEl00×)图3CpG-ODN治疗组小鼠肺组织病理切片(HE100×)Fi93ThelungtissueflromCpG-ODNtreatmentgroup(HE100×)21精品参考文献资料 优秀毕业论文图4正常对照组小鼠肺组织病理切片(1IE200×)Fig4Thelungtissuefhmcontrolgmup(HE200×)图5哮喘组小鼠肺组织病理切片图(1皿200×)Fig5Thelungtissueflromasthmaticgmup(1IE200×)精品参考文献资料 优秀毕业论文图6CpG．ODN治疗组小鼠肺组织病理切片图(HE200×)Fig6ThelungtissuefromCpG-ODNtreatmentgroup(HE200×)3．2．2AB．PAS染色检测气道黏液蛋白及杯状细胞的表达AB．PAs结果显示，正常对照组小鼠气管、支气管上皮杯状细胞不表达或仪少量表达黏蛋白，而哮喘组小鼠可见大量杯状细胞增生及黏液分泌，AB．PAS染色胞浆呈紫红色，经CpG．ODN干预后，黏蛋白分泌减少、杯状细胞增生减轻；各组比较有统计学意义(氏0．05)。(见图7～9)。图7正常对照组小鼠肺组织病理切片(AB．PAS400×)Fig7Thelungtissuefhmcontrolgroup(AB—I’AS400×)精品参考文献资料 优秀毕业论文图8哮喘组小鼠肺组织病理切片(AB．PAS400×)Fig8Thelungtissuefromasthmaticgmup(AB-PAS400×)图9CpG-ODN治疗组小鼠肺组织病理切片图(AB—PAS400×)Fig9Thelungtissue1．I．0mCpG-ODNtreatmentgroup(AB-PAS400×)精品参考文献资料 优秀毕业论文表l各组小鼠肺组织AB．PAS染色半定量分析(以=10，i±J)1’abIelSemi—quantitativeanalysisofIungtissueofmiceineachgroupinAB-PASstain(n=10．i±J)注：与J下常对照组比较，▲尸<0．01；与哮喘组比较，-尸<0．05Note：comparedwithcontrolgroup，▲尸<0．01；comparedwithasthmatic铲oup，·P<0．05，。．．。．。．．．．．．，．。，．．．，。．．．．．．．。卜●正常组哮喘组‘舶刈州治疗组组别图lO各组小鼠肺组织AB．PAS染色半定量分析Figl0Semi-quantitatiVeanalysisoflungtissueofmiceineachgroupinAB—PASstain鍪3．3CpG．oDN对哮喘小鼠BALF中细胞总数、Eos计数的影响实验结果显示：哮喘组小鼠BALF中白细胞总数、Eos计数较正常对照组明显升高(P<0．01)，经CpG．ODN干预后，BALF中白细胞总数、Eos计数与哮喘组比较明显减少(P<0．01)，差异有统计学意义，表明CpG．ODN对哮喘气道炎症有抑制作用。(见表2，图11～12)表2三组小鼠BALF细胞总数与Eos计数的比较(以=10，舅±s)1【’able2Thenumbersofwhitece¨sandeosinophilsinBALF(n=lO，i±s)注：与正常对照组比较，▲尸<0．01；与哮喘组比较，一尸2X一籁去粤蠹锺L●■糍黜●-蝴Ill铤肇一组别■一一一一图12各组BALFEos计数的比较Fig12ThecOuntsOfEosinBALF3．4BALF中炎性细胞因子IL-4和INF吖水平的变化ELISA结果显示：哮喘组BALF炎性细胞因子IL4水平与正常组相比显著升高(尸<0．01)，IFN吖水平较对照组明显下降(P<0．01)，经CpG-ODN治疗后，IL一4水平与哮喘组相比显著降低(脚．01)，IFN吖水平较对照组明显升高(P200I①)，高糖基化的糖蛋白，分子核苷酸和糖链组成。迄今已经克隆出20个黏蛋白基因【3¨¨，在正常人肺组织中至少有8种，包括MUCl、MUC2、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC8及MUCl3以IIl】}斟A的形式表达【42l。研究表明，杯状细胞(gobletcell)是呼吸道黏液的主要来源，同时它代表了哮喘时气道黏液蛋白的储存量，也是杯状细胞化生的标志1431。气道上皮MUC5AC蛋白含量和其转录水平代表了气道黏液产生分泌的强度。本研究中，我们用MUC5AC多克隆抗体免疫组化分析发现，模型组的上皮内MUC5AC，阳性染色区域均明精品参考文献资料 优秀毕业论文显增多，染色程度增强，为深黄色和棕黄色，染色范围主要是气道上皮和黏膜下腺，以及管腔内留存的黏液分泌物。通过图象分析系统分析也呈现相似的结果，与正常对照组相比，模型组气道上皮内阳性染色的光密度和黏蛋白面积％明显增高(尸<0．01)，这说明本实验成功地用建立了哮喘气道黏液高分泌模型。在支气管哮喘发病过程中杯状细胞增生(GCM)以及基底细胞、cl锄细胞向杯状细胞增生(GCH)使得气道上皮杯状细胞数目增多。GCH／M是黏蛋白过度分泌的直接后续力量，Je位ry【44】等应用较精确的统计计数比较上皮中杯状细胞数目和贮存黏蛋白间的关系，指出主要是由杯状细胞数目增加，而不是杯状细胞肥大，引起上皮贮存黏蛋白增加。哮喘与111l／Th2现在研究认为哮喘发病的重要基础是Thl胁2细胞比例和功能失衡，表现为Th2数量增多和功能亢进。IL．4和IFN吖是一对相互拮抗的细胞因子，分别代表了1111和T112的功能，Thl和Th2细胞之间以互相拮抗和自身促进的方式形成复杂有序的细胞因子网络，调节机体正常的细胞免疫和体液免疫应答。本实验通过检测BALF中IL．4和IFN吖水平，发现哮喘组与正常组比较，IL．4水平明显增高，统计学有显著性差异(尸<0．01)。目前认为，IL-4为Th2细胞分泌的代表性炎症促进因子，体现着n2细胞的主要生物学效应，同时也是原始Th0细胞向Th2细胞发育的主要诱导因子，使机体对外来抗原的免疫反应向Th2型发展；其诱导哮喘发生的机制可能为：(1)IL．4能促进抗原特异性IgE的分泌、上调IgE受体【45l：(2)诱导血管内皮细胞黏附分子(VCAM．1)的表达；(3)IL．4可促进气道黏液的分泌并激活纤维细胞和杯状细胞的增生m'47J；(4)促进哮喘气道中Eos的聚集和浸润。我们的研究发现哮喘组BALF中lL．4水平明显增高，同时也发现其与Eos水平成显著正相关(r=0．816，P