结肠癌tcadherin基因的表达及甲基化影响的探讨

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1、本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：獬眺且年』月上日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的

2、全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。Eill：丛I斗年上月士日博t学位论文中文摘要摘要目的：结肠癌是世界范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一，而DNA甲基化与结肠癌的关系密切，在结肠癌的发生发展中扮演着极其重要的角色。DNA异常甲基化是可使肿瘤抑制基因发生沉默的新型相关研究机制。本研究的主要目的是了解T．钙粘蛋白(T．cadherin)在结肠癌中的基因功能，检测T-c

3、adherin基因在结肠癌中的表达，通过去甲基化药物5．杂氮．2’．脱氧胞苷酸(5．aza．2’．deoxycytidine，5-Aza-CdR)对结肠癌细胞株在体外和体内作用的研究，检测细胞增殖、细胞周期、凋亡、T-cadherin甲基化状态改变和T-cadhefinmRNA及蛋白表达变化，探讨DNA甲基化异常与结肠癌间的相关性及5-Aza．CdR抑制结肠癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及其机制。方法：l、用5-Aza．CdR处理结肠癌细胞株HCTl16，然后采用倒置相差显微镜观察药物处理前后

4、细胞的变化；采用MTT法观察细胞的生长速度变化；采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率；用甲基化特异性PCR(MSP)检测T-cadherin基因5'CpG岛甲基化状态：采用RT-PCR和WestemBlotting法检测T-cadherinmRNA及蛋白的表达情况。2、建立人结肠癌HCTll6细胞的裸鼠移植瘤模型，比较5-Aza．CdR给药组和对照组裸鼠移植瘤生长变化，并用MSP、RT-PCR、WesternBlotting及免疫组织化学技术对裸鼠移植瘤组织进行T-cadhefin基因5'CpG岛

5、甲基化状态、mRNA及蛋白表达变化的检测。结果：1、倒置显微镜下观察发现，对照组细胞形态不规则，呈I博十学位论文中文摘要多边形，贴壁生长，核大、核分裂相多见，细胞数量和增殖速度明显快于给药组；给药组细胞大小较均匀，形态较规则，细胞变圆，皱缩，胞核固缩、增殖分裂减慢，部分细胞有凋亡和坏死；MTT检测发现5-Aza．CdR对HCTl16细胞的生长有抑制作用，随浓度的增加而增加；用5pmol／L该药处理细胞五天后，细胞G0／Gl期延长，由19．6％增加到60．8％；而S期和G2期均缩短，S期由50．8％减

6、少到24．2％，G2期由18．2％减少到16．3％；细胞总凋亡率给药组与对照组比较，其总凋亡率增加了30．27％；MSP检测经59mol／L5-Aza．CdR处理五天的HCTll6细胞后，对照组T-cadherin基因启动子区域用特异性甲基化引物扩增出目的基因带，去甲基化引物未见扩增出目的基因带，而给药组T-cadherin基因用去甲基化引物均扩增出目的基因带，但甲基化引物均未见扩增出目的基因带，未加DNA模板对照组均未能检测T-cadherin基因甲基化引物扩增片段及去甲基化物扩增片段；ImPCR

7、检测对照组T-cadherin基因mRNA不能扩增出特异性条带，而给药组HCTl16细胞中可检测到T-cadherin基因mRNA表达；WesternBlotting检测对照组HCTl16细胞中T-cadherin蛋白表达水平明显低于给药组。2、成功建立人结肠癌HCTl16细胞的裸鼠移植瘤模型，成瘤率为100％，成瘤时间为肿瘤细胞接种后第8．“天，肿瘤细胞接种后第11天，裸鼠移植瘤直径平均约4mm；5-Aza．CdR处理荷瘤裸鼠14天后，给药组裸鼠形成的肿瘤体积较对照组肿瘤体积小，肿瘤体积的差异随给

8、药时间的延长而增大，给药28天后肿瘤体积差异最明显，4周末处死裸鼠后，给药组的肿瘤体积为907+87．29mm3，对照组为1370．934-130．20ml-n3，给药组肿瘤体积明显小于对照组的肿瘤¨博十学位论文中文摘要体积(t=4．4209，P<0．005)，抑瘤率为34％；用药后各组荷瘤裸鼠用药后体重均有增加，4周末处死裸鼠后，给药组荷瘤裸鼠平均体重为18．064-1．29g，对照组为17．07+0．84g，给药组荷瘤裸鼠体重与对照组无明显变化，差别无统计学意义(