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1、八助游仆虫中心蛋白性质及功能的研究【摘要】：生命细胞中存在着一个精密的骨架系统,保证了细胞正常的形态结构与功能,而微管组织中心(microtubuleorganizingcentre,MTOC)充当着细胞骨架总设计师的角色。不同种属细胞在MTOC的名称上有也有一定的差异。在哺乳动物细胞中,MTOC被称做中心体,它随细胞周期进行复制、分离,并且在分裂期形成纺锤体的两极,是细胞的动力学中心,中心体是一个高度动态变化的结构。每一个中心体均包括两个相互垂直的中心粒(centriole)和中心粒周围物质(pericentriolarmaterial,PCM)。PCM的主要成分是蛋白质,中心蛋白即是其中的
2、一种。游仆虫中心蛋白是由168个氨基酸组成的单肽链酸性蛋白,属于钙离子结合蛋白家族成员。它含有四个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域,即所谓的EF-hand结构域,每个结构域均可结合一个钙离子。中心蛋白与钙调蛋白具有高度的序列同源性,其三维结构也可能相类似,整个分子呈哑铃型构象,氨基端和羧基端分别为哑铃的两头,各含两个EF手结构域,中间由一段8个氨基酸残基组成的弹性α-螺旋相连。本研究利用基因重组技术,在已有八肋游仆虫中心蛋白基因的基础上,构建得到了半分子中心蛋白基因(N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen)的重组表达质粒和带有突变位点G151W的重组质粒。分
3、别为①pGEX-6p-N-EoCen、②pGEX-6p-SC-EoCen、③pGEX-6p-LC-EoCen、④pGEX-6p-M-EoCen(G151W)、⑤pGEX-6p-M-SC-EoCen(G151W)、⑥八助游仆虫中心蛋白性质及功能的研究【摘要】：生命细胞中存在着一个精密的骨架系统,保证了细胞正常的形态结构与功能,而微管组织中心(microtubuleorganizingcentre,MTOC)充当着细胞骨架总设计师的角色。不同种属细胞在MTOC的名称上有也有一定的差异。在哺乳动物细胞中,MTOC被称做中心体,它随细胞周期进行复制、分离,并且在分裂期形成纺锤体的两极,是细胞的动力学中
4、心,中心体是一个高度动态变化的结构。每一个中心体均包括两个相互垂直的中心粒(centriole)和中心粒周围物质(pericentriolarmaterial,PCM)。PCM的主要成分是蛋白质,中心蛋白即是其中的一种。游仆虫中心蛋白是由168个氨基酸组成的单肽链酸性蛋白,属于钙离子结合蛋白家族成员。它含有四个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域,即所谓的EF-hand结构域,每个结构域均可结合一个钙离子。中心蛋白与钙调蛋白具有高度的序列同源性,其三维结构也可能相类似,整个分子呈哑铃型构象,氨基端和羧基端分别为哑铃的两头,各含两个EF手结构域,中间由一段8个氨基酸残基组成的
5、弹性α-螺旋相连。本研究利用基因重组技术,在已有八肋游仆虫中心蛋白基因的基础上,构建得到了半分子中心蛋白基因(N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen)的重组表达质粒和带有突变位点G151W的重组质粒。分别为①pGEX-6p-N-EoCen、②pGEX-6p-SC-EoCen、③pGEX-6p-LC-EoCen、④pGEX-6p-M-EoCen(G151W)、⑤pGEX-6p-M-SC-EoCen(G151W)、⑥pGEX-6p-M-LC-EoCen(G151W)。并且将这些重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21中,经IPTG诱导获得了中心蛋白的可融性表达,经GST亲和层析、阴
6、离子交换层析和分子筛层析多步纯化得到了纯度较高的蛋白。为游仆虫中心蛋白的化学性质以及生物功能研究准备了必要的材料。通过圆二色谱和荧光光谱研究了中心蛋白与金属离子(Ca~(2+)、Tb~(3+))之间的相互作用。研究发现金属离子与中心蛋白结合引起蛋白的二极结构以及高级结构改变。金属离子存在时中心蛋白的疏水性结构域外露,可能蛋白从关闭式状态转变为开放式状态。蛋白的酪氨酸残基与Tb~(3+)之间发生无辐射能量转移而使Tb~(3+)荧光得以敏化和Ca~(2+)竞争Tb~(3+)猝灭该敏化荧光的事实表明Ca~(2+)、Tb~(3+)与中心蛋白的结合位点为同一位点,而且结合顺序一致,即金属离子优先占据C-
7、端结构域的第Ⅳ部位、其次为Ⅲ部位、最后为N端结构域的Ⅰ、Ⅱ部位。由蛋白质结合铽的荧光敏化求得了铽离子与中心蛋白不同金属离子结合部位间的结合常数,分别是:K_(a(Ⅳ))=1.23×10~8M~(-1)和K_(a(Ⅰ、Ⅱ))=2.01×10~6M~(-1)。通过钙对铽荧光的竞争性猝灭测得钙与中心蛋白质的结合常数分别为:K_(a(Ⅳ))=6.82×10~5M~(-1)和K_(a(Ⅰ、Ⅱ))=1.13×
