八肋游仆虫rab家族新成员eo-rab-1n基因克隆、表达及蛋白纯化

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1、摘要真核细胞中细胞器在空间上分布不同，各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关，在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。纤毛虫是单细胞的原生动物，在进化上属于低等的真核生物，但其各细胞器之间囊泡运输系统极为完善。研究Rab蛋白在单细胞真核生物八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)中的功能对阐明囊泡定向运输机理具有重要意义。本实验运用PCR、RT-PCR等技术，从八肋游仆虫中克隆到一种新的tab基因。序列分析结果表明：在大核中，该基因全长

2、884bp，除去两端的端粒与非编码区，该基因在大核中由723bp组成。从小核中克隆相应的基因片段，此基因片段序列与大核中序列一致，表明该基因在小核中无内部删除序列的存在。通过RT-PCR，从mRNA获得的该基因的开放读框为663bp，表明该基因在转录过程中有内含子的删除。大核基因序列和cDNA序列比较，发现60bp的内含子序列位于大核基因的153bp一212bp之间，并符合一类内含子GU．AG剪切规则。在遗传密码使用上，该基因内部含有2个TGA，在游仆虫中编码半胱氨酸。同时首次发现，八肋游仆虫基因使用TAG作为终止密码子。NCBI上序

3、列比对表明该基因翻译的蛋白与其它物种Rabl蛋白的同源性达49—52％，因此我们将它命名为Eo—rab一，Ⅳ。将从mRNA水平上克隆到的Eo—rab—IN中两个TGA突变为TGC。突变后的Eo—rab一1N构建于原核表达载体pRSETc中。PRSETc—Eo—rab一1N转化E．coliBL2l(DE3)，经IPTG诱导、SDS—PAGE分析及Western—blotting鉴定，目的蛋白获得可溶性表达。分别在诱导温度、诱导时间以及诱导剂浓度水平上对表达条件进行优化。结果表明，加入IPTG使其终浓度为0．1mM，在37℃诱导10小时，

4、目的蛋白获得最大量的可溶性表达。表达产物经IMAC金属螯合亲和层析、Resource—e阴离子交换层析及Superdex75分子筛层析纯化，获得电泳纯的蛋白。Western．blotting分析表明该蛋白为融合有6个His的Eo—rab一1N蛋白。关键词：八肋游仆虫；Eo—rab—IN基因：基因克隆；内含子ABSTRACTCellularorgandiesofeukaryoteshaveadistinctivespatialdistributionandcommunicatethroughanelaboratesystemofvesi

5、cular-tubulartransport．Rabproteins，behavingasmolecularswitchesofvesiculartrafficking，playanimportantroleindifferentstepsofvesiculartrafficking．Ciliate，aunicellularprotozoaandloweukaryotesinevolution，hasperfectvesiculartraffickingsystemamongorganelles．It’Smeaningfultostu

6、dythefunctionofRabproteinsinciliatesandfurthertoexplicitthemechanismofvesiculartrafficking．Inthisstudy,arabgenewasobtainedfromEuplotesoctocarinalusbypolymerasechainreaction(PCR)andRT-PCR．TherabgenefrommacronucleicDNAwas884bpinlength，includingnon—codingregionsandtelomeri

7、csequencesatbothends．TherabgenefrommicronuclearDNA(723bp)，Jackingofintemaleliminatedsequences，wasidenticaltorabgenefrommacronuclearDNA．RT-PCRshowedthattheopeningreadingflameoftherabgenewas663bplong．TherabgenefrommacronuclearDNAcontainedanintronof60bpatthepositionfrom153

8、bpto212bpofmacronuclearDNA．Therabgenehadtwoin—frameTGAsencodingforcysteineinEuplotesoctocarinatusTherabgeneuse