八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究.doc

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1、八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究【摘要】：中心蛋白是EF-hand钙结合蛋白，是钙调蛋白超家族中的一员。它含有4个EF-hand结构基元，每个结构基元能结合一个钙离子，是很多生物体(如藻类、酵母、原生动物、高等植物、哺乳动物等)的中心体(基体或纺锤极体)的重要组成部分。中心蛋白在细胞的正常分裂以及包含中心蛋白的纤维系统收缩中起重要作用。八肋游仆虫是一种进化上处于特殊地位的单细胞真核生物，存在于八肋游仆虫的中心蛋白是由168个氨基酸残基组成的单肽链

2、酸性蛋白质，分子量约为20KD，不含半胱氨酸和色氨酸。对该中心蛋白的研究，不仅有助于阐明低等真核生物的细胞分裂、细胞运动等重要生命活动过程的本质，而且将其用作稀土离子进入生物体细胞内的主要靶蛋白的模型，对深入研究稀土生物学效应的化学基础具有重要意义。首先利用PCR技术，在野生型八肋游仆虫中心蛋白的基础上得到4个定点突变体(G115W、D37K、D73K、D146K)和2个截短中心蛋白分子(P23、P123)的基因片段，序列测定表明构建的基因片段和预期的设计相吻合。采用基因重组技术，将这些不同的目的基因片段分别与表达载体pGEX-6p-1连接，转入大

3、肠杆菌BL21菌株，分别获得重组菌，经IPTG诱导实现可溶性融合蛋白表达。经GST亲和层析和HitrapQ离子交换层析两步纯化，获得了115色氨酸、37、73、146位赖氨酸突变蛋白，以及包含62-137和1-137位氨基酸的截短蛋白P23和P123。纯度达95％以上。在生理条件下运用紫外差光谱、圆二色谱和荧光光谱研究了中心蛋白与钙、铽离子的结合性质。圆二色谱、紫外差光谱测定表明，钙、铽离子与蛋白质的结合都能引起蛋白质二级结构发生变化、α螺旋含量增加、酪氨酸残基的化学微环境改变。TNS疏水探针监测钙离子和铽离子诱导蛋白质构象变化及钙和铽引起中心蛋白

4、的共振光散射现象都表明铽离子和钙离子与中心蛋白结合有相似的性质。因此，使用能与蛋白质结合后表现明显荧光敏化的铽离子为荧光探针研究中心蛋白的金属离子结合性质是合理可行的。中心蛋白酪氨酸与铽离子无辐射能量转移的铽敏化荧光滴定表明野生型中心蛋白的四个钙离子结合部位可分为两类：N-端Ⅰ、Ⅱ位点为低亲和位点，C-端Ⅲ、Ⅳ位点为高亲和位点；突变蛋白G115W的铽敏化荧光滴定表明，C-端的两个金属离子结合部位结合金属能力是不等同的，第Ⅳ位点的结合能力大于第Ⅲ位点；D37K、D73K、D146K由于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点loop区的第一个氨基酸被分别突变为K，而导致分别

5、丧失了第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的金属离子结合能力，说明EF-手loop区的第一个天冬氨酸残基在与金属离子结合中至关重要；片段分子P23和P123仍保持原金属离子结合部位的结合能力。中心蛋白的聚合行为可能是其发挥纤维收缩功能的化学基础。共振光散射技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明中心蛋白的聚合行为依赖金属离子的结合，D37K、D73K、D146K由于丧失了部分金属结合性质，聚合程度有大小不等的减弱；聚合过程分为两个阶段，C-端结合金属离子后聚合程度小，N-端结合金属离子后聚合程度大。P23和P123片段分子的共振光散射实验表明，片断分子的聚合小于全分子的

6、，P23由于缺乏N-端而聚合最小。说明中心蛋白的聚合是全分子的全部结合位点共同参与的过程。离子强度增大和疏水探针TNS浓度增大的都能减弱中心蛋白的聚合，说明聚合过程是静电作用和疏水作用共同起作用。此外，蛋白质浓度、酸度、温度等也对蛋白质的聚合行为有一定的影响。铽离子比钙离子更能促进聚合。TNS检测中心蛋白构象变化实验表明：中心蛋白结合金属离子后发生的构象变化使蛋白质的疏水区更加暴露；C-端结合金属后构象变化(疏水区暴露)小，N-端结合金属后构象变化(疏水区暴露)大。这个过程也明显地分为两个阶段，和聚合行为是对应的。蜂毒素是常用于钙调蛋白与靶目标作用

7、研究的模拟靶肽。本文使用蜂毒素为靶肽研究了野生型中心蛋白、定点突变体(G115W)及截短中心蛋白分子(P23、P123)与靶目标的作用。结果显示：在pH7.4、10mMHepes条件下，中心蛋白可与蜂毒素稳定结合，形成1：1的配合物，该结合行为不依赖金属离子的结合；相同条件下P23、P123不与蜂毒素结合。即C-端结构域是中心蛋白与靶目标作用的功能区，而N-端结构域是中心蛋白聚合行为的功能区。最后研究了中心蛋白和三氟啦嗪——钙调蛋白的功能阻断剂的作用。发现中心蛋白能结合4个三氟啦嗪，结合后既减弱了中心蛋白的聚合行为，也很大程度地影响中心蛋白与蜂毒素

8、的结合，表明三氟啦嗪是中心蛋白可能的生物功能阻断剂。【关键词】：中心蛋白金属离子聚合构象变化【学位授予单位】：山西大学【学