生隐球菌荚膜相关基因的实验分析

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1、m=1i瞰人学阱11沦义卜止摘撄中文摘要根拱·j新，I-_隐球菌多聚糖荚膜成分和生化方面的差异，人们将新，Ii隐球闭分成3个变种，5个血清型，其一中新生变种(血清型A、D和AD)存在世界范㈣均』：壤和鸟粪t扎与免疫力低下的患者，尤其是爱滋病患者的隐球菌病有榭关性，Ⅲ格特变种(j】!【1．清型B和C)和上海变种(血清型B)，严格局限于热带和豫热帮地区，通常引发免疫正常人的隐球菌病，因此研究新生隐球菌不同的m清型与致病性之间的关系足重要的流行病学研究课题。临床上主要用免疫学方法检测抗瓶!t-：隐球菌奘腆多聚糖的扰体，对其进行血清分型，但是该法有时剥‘某蝗临床分离株小能!挂定。尽管

2、已确。一螳分子，F物学的技术补充了免疫学疗法的局限。盹，似心

3、j；i眯l二仍然需要新的、较准确的和简便的方法术对新生隐球菌进行血消型分趔．，JuneKwon．Chung和她的合作者利用新生隐球菌DNA文库互补’弘帅焚膜块陷株，U经克隆了4个与英膜合成有关的荚膜基因(CAP59，CAP64，CAP60和CAP[0)．这螳荚膜相关基因是新生治球菌荚膜合成的必需基因，这些英麒罄㈨tI，

4、：新牛隐球随荚膜生化合成途径中的作用是不明确的，但是多聚糖必媵成分是新，L隐球菌分型的物质基础，因此它们是找到与分型的物质基础最榭关和最可能的地方。mmCAP艇因与新生隐球菌

5、：lIL清型分型之间的

6、研究并／1i多，仅发现1；刚椭消)艘靳牛隐球菌CAP59撼闲部分序列有差异性。因此我们根掘实验的条件和财山，选择新生隐球菌的CAI，59和CAP64基因作为研究对象，束探讨这两个璀川在榆测新￡卜隐球菌病原体和姐清型分型中的意义，以期对临床榆测新生隐球黼捉供fJ川的分r生物学：。【：具。蒯内研究发现，无英膜的突变株和定向的荚膜基

7、)

8、jl缺失株在动物模J眇11无撤病性，“I它们用野￡E型荚膜基因互补后，菌株形成荚膜，在动物模型中愀短海性作用，这些研究结果在分子水平证实了荚膜在新生隐球菌毒性方面的雨婴性，似是人们仍然刁i清楚CAP纂因在荚膜合成途径中的作用。荚膜基因产物11

9、勺定

10、位研究剥’探索这·难题足必不可少的步骤，已有的相关研究袭l叭，H常枷免疫组织化。≯吖内疗法定位新生隐球菌CAP荩因产物是非常刚难的。绿色佚光蛋白{C；FP)在许多生物蛋白质定位研究中已经褂到较多的远削．J。不需要固定、沈涤、封闭和染色的步骤，可以直接观察单个活细胞内的稿刚钔q!瞰人‘学睥I‘论史虻摘咄表达。1999年，ChangYC等首次将GFP用于新生隐球菌CAPt0产物的定做研究，l-I：l』二技术原刚仅仅观察到CAPl0基因产物的细胞位鬣。本课题的另目的就足深入研究N；t-EI球菌CAP59和CAP64基因的功能，并将GFP基嘲作为报告基例引入新生隐球菌的荚膜基因产物的

11、定位研究中。实验方法1．新乍隐球黼荚膜相关基阏CAP64的克隆和在检测病原体方耐的意义：根川新牛隐球菌(m清型D)CAP64荚膜基因的序列设计众多引物，将引物一辱4GenBank进}『比对．找到特跸性最好的引物进行研究和验舐。随后将没汁的引物F-．增5个标准m浦型新生隐球菌，已分型和未分型新生隐球菌临床分离株，以及其它的致稍真菌，以寻找引物的型特异性。2．新，±i隐球简荚膜相关基因(．：AP59最大外显=j!：的序列分析和在枪测瘸原体方而的意义：分析c胛59荚膜缺陷株CAP59基因最大外显子的序列与其来源菌株新，卜隐球菌13-350l相应序列的差别，以期发现浚序列中与cAP5

12、9基因功能有荚的硷Jl变计；joi过分析5个标准toti青型菌株CAP59肇因的最大外耀子序列弓D)靶向0菏’叫新，

13、i隐球蔺CAP59臻因的最大外显子序列的差别，来探索利用CAP59基吲最大外娩r序列I要分5个m清型新生隐球菌分予生物学揍础和分析新"-t

14、

15、j；j床分离株以及其它擞病真菌进行CAP59最大外显子序列的扩增，来研究CAP59的最大外盟f在新巾隐球菌检测痈原体方面的意义。3．N!I-．隐球菌cap59和CAP64英膜缺陷株lira突变株的筛选和鉴定：通过体外撼闪蘑组拽术，用大多数酵母都

16、敏感的G418基因插入到新生隐球菌CAP基洲英膜缺陷株1．2KbURA5基因的特定序列，用电转化将上述的重组片段导入荚膜缺陷株，呵定阳获得具有G418抗性的ura5突变株。考虑到新生隐球菌基闲的例源船介率．附新氐，我们同lI,-J用硫酸：：已酯化学诱变剂，列新￡Ii隐球黼CAP59、CAP64币¨CAPl0蜓膜缺陷株诱变。4．绿色荧光蛋白GFP双因和CAP基因融合表达载体的初步构建：以转化兜褥维孵f斗n勺穿梭质粒pCXJl8作为罄础，将CAP64基因、GFP旗因及新生隐眯菌的URA5牲陶顺序置于GAL7