f1-np诱导人肝癌hepg-2细胞自噬的实验研究

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1、延边大学硕士学位论文摘要目的探讨5，2’，4。．三羟基．6，7，5’．三甲氧基黄酮(TTFl-NP)对人肝癌HepG．2自噬的影响及其相关的作用机制方法通过MTT法检测不同浓度(15．240uM)的TTFl-NP作用不同时间(12h，24h，48h)后对HepG．2细胞存活率的影响；利用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，H撇)观察细胞中自噬体的形成；WesternBlot检测TTFl-NP在不同浓度和不同时间下作用HepG．2细胞后自噬标志蛋白LC3．II、Beclin．1的表达，及P13K／Akt／mTOR通路中Akt、p-Akt、mTOR、p

2、-mTOR和MAPK／JNK通路中p-JNK的蛋白表达情况。结果1．MTT法细胞活力检测：TTFl-NP能够降低HepG．2细胞的存活率，并且随着药物浓度和作用时间的增加，抑制增殖作用越明显，且呈现一定的浓度．时间依赖性，差异具有统计学意义。2．透射电子显微镜检测：TTFl-NP作用后，HepG．2细胞中有典型双层膜结构的自噬体及单层膜的自噬溶酶体出现，提示TTFl．NP诱导HepG．2细胞自噬的产生。3．自噬标志蛋白检测：利用WesternBlot对LC3．II、Beclin．1蛋白检测得出，对照组中，两种蛋白表达水平较低，随着药物浓度及作用时间的增加，LC3．II、Beclin．1蛋白

3、表达水平逐渐增加，自噬水平升高。4．P13K／Akt／mTOR通路蛋白检测：WesternBlot检测结果显示，对照组细胞p-Akt，p-mTOR表达水平较高，随着TTFl-NP药物浓度和作用时间增加，二者的表达逐渐降低；加入P13UAkt／mTOR通路激动剂insulin后，与对照组相比，insulin+对照组中的p-Akt，p-mTOR表达升高(P<0．05)；TTFl．NP+insulin组中p-Akt，p-mTOR较TTFl一NP组表达升高(P

4、-JNK随着TTFl．NP药物浓度和作用时间的增加表达逐渐升高。加入JNK抑制剂SP600125后，万方数据延边大学硕士学位论文TTFl．NP+SP600125组中的p-JNK、LC3．II的蛋白水平较TTFl-NP组降低，差异显著，而与对照组相比，二组中的两蛋白显著升高(P

5、biective：ToobservetheautophagyofHepG一2cellinducedby1TFl—NPandexplorethepossiblemechanism．Method：TheviabilityofHepG·2cellsthatweretreatedbyTTF1-NPwithdifferentdose(15-240gM)indifferenttime(12h，24h，48h)wasmeasuredbyMTTassay．Autophagosomesandautolysosomeswereidentifiedbytransmissionelectronmicroscopy

6、．WesternBlotwereperformedtoanalyzetheproteinlevelofLC3一II，Beclin一1，andproteinsinP13K／Akt／mTORsignalpathway(Akt，p-Akt，mTORandp-mTOR)andinMAPK／JNKsignalpathway(p-JNK)inducedbyTTF1-NPwithdifferentdose(80“M，160gM，240gM)anddifferenttime(24h，48h，72h)．Result：1．AftertreatmentofTTF1一NP，thegrowthofHepG一2cel

7、lsweresignificantlyinhibitedindose·timedependentmanner．2．Accordingtotransmissionelectronmicroscopyresults，autophagosomeswithdouble—membraneandautolysosomeswerefoundinTEMpictures．ThisfindingsuggestedthatTTF1一NPind