徐州四种市售食用菌的分子鉴定

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1、徐州四种市售食用菌的分子鉴定摘要：本文通过扩增食用菌的ITS序列对徐州市售双孢蘑菇、香菇、杏鲍菇和草菇的分类学地位进行了研宄，将4种食用菌的ITS序列与Eztaxon数据库屮真菌模式菌株数椐进行比对，选取亲缘关系最近物种的ITS序列，采用Clustalx1.8软件和MEGA5.0软件构建分子发育树。研究结果为双孢蘑菇、香菇、杏鲍菇和草菇的ITS序列长度分别为677bp、672bp、605bp和643bp；4种食用菌与亲缘关系最近物种构建的分子发育树表明，双孢蘑菇与模式菌株Agaricusbisporus（登录号:AJ133385）序列相似性为100%；香菇与模式菌株Lentinu

2、laedodes（登录号:JQ797414）序列相似性为100%;杏鲍菇与模式菌株Plcurotusostrcatus（登录号：AB733143）序列相似性为100%;草蘇与模式菌株Volvariellavolvacea（登录号：AY636049）序列相似性为99%。初步确定双孢蘑菇力蘑菇属的Agaricusbisporus；香菇为香菇属的Lentinulaedodes;杏?U菇为侧耳属的Pleurotusostreatus；草菇为小包脚燕属的Volvariellavolvacea。关键词：食用菌；ITS序列；分子鉴定中图分类号：S646文献标识码:AD0I：10.11974/n

3、yyjs.20160912001我国食用菌种质资源丰富，而传统食用菌的分类鉴定主要是基于菌丝、孢子和子实体的形态学特征和生理生化特征。真菌形态特征易受到培养条件的影响，许多子实体类型难以获得，增加了分类鉴定的难度。真菌核糖体基因转录间隔区（Internaltranscribedspacer，简称HS）是位于真菌核糖体RNA上18S和28S基因之间的片段，其两侧分别是18SRNA基因和28SRNA基因［1］，长度一般为650〜750bp。White等于1990年设计了ITSKITS4>ITS53对可用于大多数担子菌和子囊菌的特异性鉴定引物［2］,此后ITS序列分析技术在真菌分类和鉴

4、定的研究中得到广泛应用。如李晶等采用形态学鉴定方法与现代分子生物学技术相结合将1种野生食用菌鉴定为金山巨菇(Tricholomasp.)［3］，雷琼等也采用同样的方法将一种人型食用菌鉴定为硫磺菌(Laetiporussulphureus)［4］。木研宄通过市售食用菌子实体的形态特征进行观察，结合ITS序列分析初步确定分类学地位，为食用菌种质资源提供了依据。1材料与方法1.1供试材料供试双孢蘑菇、秃菇、杏鲍菇和草菇购自徐州市铜山新区农贸市场，编号分别为Wl、W2、W3和W4。1.2子实体形态观察取完整子实体，观察并描述菌盖、菌褶和菌柄等。1.3DNA提取将新鲜的子实体烘干后粉碎成粉

5、末并过筛，储存备用。称取适量样品粉末，放入研钵中加入液氮碾磨充分破碎细胞，将碾磨碎粉转入离心管中，样品DNA的提取方法参照改进的CTAB法［5］进行。提取的总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.4ITS区段的PCR扩增采用通用引物nSl(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）与ITS4（5’_TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’）［2］扩增食用菌的ITS序列。PCR反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性40S，55°C退火45S，72°C延伸lmin,30个循环；最后72°C延伸10min。PCR产物4QC条件下保存。取5pL产物进行1%的琼脂糖

6、凝胶电泳检测。1.3PCR产物的纯化和测序采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA。具体步骤参照试剂盒说明。经胶回收纯化后的PCR产物送至南京斯普金生物科技有限公司完成测序。1.6系统发育树的构建将测序所得Wl，W2,W3,W44种食用菌的ITS序列与Eztaxon数裾席中真菌模式菌株数据进行比对，选取亲缘关系最近物种的ITS序列，采用Clustalx1.8软件和MEGA5.0软件以Neighbor-Joining法构建分子发育树［6］，重复取样1000次［7］。2结果与分析2.1子实体形态观察食用菌子实体形态见图1，具体特征如下：W1：菌

7、盖近半球形，白色，光滑；菌肉白色，厚；菌摺褐色至黑褐色，密，窄；菌柄近圆柱形，白色，光滑；具菌环，单层，膜质。W2：菌盖扁平，边缘内卷，表面浅褐色至深褐色，边缘常有毛状或絮状鳞片；菌肉白色，稍厚；菌褶白色，密；菌柄屮生，白色，弯曲。W3：菌盖圆碟状，浅褐色；菌摺延生，密集，乳白色；菌柄偏生，中实，棒状，表面平滑，无菌环。W4：菌盖近钟形，中部稍凸起且色深，边缘完整；菌褶着生于菌盖下方，稍密；菌柄着生于菌盖下方中央，白色稍带黄色。2.2系统发育分析基于ITS基因序列，对Wl,W2,