关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达

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1、关于大藏羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达羊膜位于胎盘绒毛膜内侧，是一层无血管、神经、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到对胎儿的保护作用，与发育中的胎儿联系紧密。人源羊膜细胞在受精后第8天开始形成，具有多项分化的潜能，可向三个胚层细胞进行分化，近年来研究表明，羊膜上皮细胞能够分化为成熟的神经细胞，并合成释放多巴胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素等神经递质。人羊膜细胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，细胞移植后不会发生急性排斥反应。本实验从大鼠羊膜分离获取羊膜细胞，建立稳定培养的条件，并对其生物学特性进行了探讨，为其将来在细胞移植治疗方面的应用提供实验依据。1材料和方法

2、：1.1材料1.1.1主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。1.1.2主要试剂：DMEM高糖培养基(DulbeccosmodifiedEaglesmedium,DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、％含EDTA的胰蛋白酶(0.25%trysin-EDTA)、胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS缓冲液购自于Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90购自与A

3、beam公司。CD29、CD44购自于eBioscience公司、CD45、CD1lb购自于BD公司。1.1.3实验动物:SPF级孕18〜18.5d的SD大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号：［SCXK-(军)2014-0004］，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。1.2方法1.2.1羊膜细胞分离及培养:SD孕鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.01mL/g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500U/mL双抗的PBS溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500U/m

4、L双抗的DMEM基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1mm3左右的小块。将组织悬液移至50mL离心管中，1000r/min离心5min,弃上清液。加入0.25%含EDTA的胰蛋白酶10mL,37°C，5%CO2条件下消化20〜30min。用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。200目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至25cm2培养瓶，含10%FBS、10g/LEGF和500U/mL双抗的DMEM完全培养基培养，隔天细胞换液，2〜3d后细胞长满培养瓶85%〜90%时，进行细胞传代。1.2.2流式细胞术检测:取培养2〜4代细胞，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化

5、，含10%FBS的DMEM完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1106个，每个流式管1mL细胞悬液。每流式管加2mLPBS使细胞混匀，2000r/min离心5min,弃上清液。重复加2mLPBS重悬细胞，2000r/min离心5min,弃上清液。每管加50LPBS重悬细胞，加抗体CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-HTC、CD45-PE-CY7、CDllb-APC,避光室温孵育30min。每管加2mLPBS重悬细胞2000r/min离心5min,弃上清液。各管加300LPBS重悬细胞上机检测。1.2.3免疫荧光细胞染色:取2〜4代细胞，0.2

6、5%含EDTA胰蛋白酶消化，含10%FBS的DMEM完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24孔板中培养。待细胞增殖至70%作用时，PBS冲洗，4%多聚甲醛(预冷)固定10minoPBS冲洗2次，每次5mim。1%Tuiton-100孵育10min。PBS冲洗2次，每次5mim。山羊血清工作液每孔100L室温下封闭30min。吸去山羊血清工作液，抗体200）、稀释液稀释抗体Oct-4(1:200)、Sox-2(1SSEA-4(1:200)、nestin(l:100)、vimentin(l:100)，每孔100L，4°C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5mi

7、n。避光条件下，PBS稀释FITC标记的羊抗鼠二抗(1:200)，37°C避光孵育30min。PBS冲洗3次，每次5min。DAPI封片剂封片。共聚焦荧光显微镜观察。1.3统计学方法实验结果采用x铆s表示，使用SPSS统计软件进行统计处理，对其进行单因素方差分析和LSD检验，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1分离细胞培养分离培养大鼠羊膜细胞，镜下，细胞呈变形虫样生长（图la），生长速度快（图lb），需隔天换液传代。本实验中大鼠羊膜细胞可传至6〜7代。1.2流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果经流式细胞术鉴定大鼠羊膜细胞间充质细胞表面标记物CD29、CD

8、44分别为97.6%和95.8%0细胞表面抗原CD9