brdu标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用

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1、BrdU标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用【摘要】目的:探讨大鼠睾丸支持细胞原代培养5溴2脱氧尿苷（BrdU）的最佳标记时间、剂量。方法:大鼠睾丸支持细胞进行体外原代培养;以终浓度分别为5、10、15、20μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量;在细胞培养的12、24、36、48h掺入BrdU,使终浓度为15μmol/L,测定BrdU的最佳标记时间;免疫细胞化学法跟踪观察大鼠睾丸支持细胞在体外培养中的分化发育情况和BrdU标记率。结果:免疫组化检查提示最终浓度为15μmol/L和孵育36hBrdU标记率均>90%,并且

2、连续传3代均可检测到。结论:终浓度15μmol/L及孵育36h为BrdU标记睾丸支持细胞的最佳剂量及时间,表明BrdU标记可用于睾丸支持细胞体内后的存活、生长的动态观察。【关键词】睾丸支持细胞体外培养BrdU5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法作为一种简便、敏感、特异的检测方法,在医学的各个领域都有广泛的应用。BrdU掺入合成的强度可直接显示细胞增殖的能力,同时能避免以往应用3HTdR检测对细胞的放射性损害[1]。睾丸支持细胞缺乏有效的标记方法,因此本实验的目的是应用BrdU体外标记原代大鼠睾丸支持细胞（sertoli10cell）,观察最佳标

3、记时间及标记量,从而为追踪BrdU标记的睾丸支持细胞移植入体内后的存活、生长及分化的动态变化过程打下基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　SD雄性大鼠（体质量约100g,17～22日龄）购于第四军医大学动物试验中心;DMEMF12培养基、优质胎牛血清购自Gibco公司,胶原酶、胰酶、BrdU购自Sigma公司;抗BrdU抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠睾丸支持细胞体外分离培养　　取大鼠睾丸,剥除被膜,收集睾丸实质于50mL离心管中,4℃900r/min离心4min,倾去上清。按每克睾丸组织加8mL2.

4、5g/L胰蛋白酶,32℃210r/min振荡、消化30min。加入培养液终止消化,待组织沉降后,弃去上清。重复此步骤3次。再以每克睾丸组织加6mL1g/LⅠ型胶原酶,34℃210r/min振荡,消化30min。用100目钢筛过虑收集细胞,900r/min离心10min,收10集细胞,用含100mL/L胎牛血清的培养液洗3次（900r/min,3min）,稀释细胞至1.5×109/L,接种于25cm2塑料培养瓶。34℃、CO2培养箱中50mL/LCO2培养48h,于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况（图1）,吸去培养液后加入20mmol/L,pH7.4的T

5、risHCl缓冲液低渗处理3min后,用培养液洗涤2次,洗去大部分生精细胞。加入含100mL/L胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养,逐日更换培养液并进行观察。　　1.2.2传代后大鼠睾丸支持细胞的鉴定　　将培养的支持细胞用2.5g/L胰酶消化并洗涤后,接种到1个6孔板中,并在6孔板中各孔加入1块经多聚赖氨酸包被的盖玻片,将细胞放入培养箱中继续培养,待细胞生长于载玻片后,将载玻片取出,在Carnoy中固定12min。950mL/L、700mL/L乙醇、蒸馏水及盐酸分步漂洗;置于60℃的1mmol/LHCl12min后在冷盐酸中漂洗;chiff

6、试剂内2h;入100mL/L偏重亚硫酸钠溶液除去非特异染色后,经自来水、蒸馏水、700mL/L、950mL/L及1000mL/L乙醇分步洗涤,固绿染色;显微镜下观察并摄片（图1）。收集培养6～8d的支持细胞,在25g/L戊二醛固定液中预固定,经锇酸后固定、脱水、包埋、半薄切片定位、超薄切片等步骤后,在JEOLJEM1220透射电子显微镜下观察其超微结构。10　　1.2.3BrdU标记方法　　每日观察细胞生长情况,绘制大鼠睾丸支持细胞生长曲线。以1×105/L将睾丸支持细胞接种于爬片处理的6孔板中,并以终浓度分别为5、10、15、20μmol/L的

7、BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量;在细胞培养的12、24、36、48h掺入BrdU,使终浓度为15μmol/L,测定BrdU的最佳标记时间;设定正常对照组观察BrdU有无细胞毒性。随机数取10个非重叠视野（×100）,计算BrdU阳性细胞占总细胞数的比例。　　1.2.4BrdU标记免疫组化染色　　具体步骤如下:（1）PBS清洗标本3次各1min;（2）40g/L多聚甲醛固定30min,PBS冲洗5min,3次;（3）30mL/LH2O2于室温封闭内源性过氧化氢酶30min,PBS冲洗5min,3次;（4）2NHCl于室温下变性30～45min

8、,使其双螺旋打开暴露BrdU标记部位。（5）1∶20正常山羊血清封闭20min,甩去多余的液体不洗;（6）抗BrdU一抗（