黄藤素片微生物检验方法验证中加菌方法的比较研究

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1、黄藤素片微生物检验方法验证中加菌方法的比较研究【关键词】微生物方法验证；抑菌作用；离心法　　〔摘要〕目的：比较黄藤素片微生物方法验证中的加菌方法不同，所出现的回收率差异。方法：采用离心法薄膜过滤法弃除黄藤素片中的抑菌成分。结果：离心前加入阳性对照菌所得回收率非常低，采用薄膜过滤法的阳性对照菌所得回收率可达70%以上，两者有显著性差异。结论：薄膜过滤法最后一次冲洗加入阳性对照菌仅能说明黄藤素片的抑菌作用可采用离心薄膜过滤法弃除，而不能反映该药品在生产、运输、贮藏过程所污染的微生物。　　〔关键词〕微生物方法验证；抑菌作用；离心法薄膜过滤法　　As

2、tudyonthemicrobiologyverifyingtestofHuangtengsutabletdifferentmethodsinputtingbacterialinmicrobiologyverifyingtestofHuangtengsutablet.Methods:ThecentrifugalizationandmembranefiltrationHuangtengsutablet.Results:Therecoveryrateofthebacterialputintodrugbeforecentrifugalization

3、thatafterthelastembancefiltration.Conclusions:Theresultofputtingbacterialintodrugaftermembranefiltrationmaynotillustratesomebacterialcontaminatedinproduction,transportationandgarner.　　〔Keyembranefiltration　　2005版《中国药典》在药品微生物限度检验方法项下增加了方法学验证的内容，特别对有抑菌作用的药品指出可采用离心沉淀集菌法、薄膜过滤法或

4、联合使用这些方法消除抑菌作用，并要求阳性菌的加入方法是最后一次滤膜冲洗时。针对黄藤素片的抑菌情况，笔者采用离心薄膜过滤法消除其抑菌，并就其加入阳性对照菌的方法进行了比较，发现加入阳性对照菌的方法不同，所得到的回收率差异是非常显著的。　　1材料和方法　　1.1试验材料　　1.1.1样品黄藤素片分别由玉溪维和制药有限公司（批号20040113，样品1）、昆明制药有限公司（批号20040452，样品2）、云南滇池制药有限公司（批号20040701，样品3）提供。　　1.1.2稀释剂及培养基无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）按药典配制，TTC营养琼脂培养

5、基、营养肉汤培养基〔1〕均来源于北京三药科技开发公司。　　1.1.3阳性对照菌大肠杆菌〔CMCC（B）44102〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕〔1，2〕，由中国药品生物制品检定所提供。　　1.2方法　　1.2.1供试品的制备分别取样10g，匀浆后加入无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）至100mL，制成1∶10供试液备用〔1〕。　　1.2.2阳性菌液制备取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18～20h后用无菌磷

6、酸盐缓冲液（pH7.2）稀释至相应的浓度〔1〕，备用。　　1.2.3试验Ⅰ组分别吸取1∶10约含50～100个/mL阳性菌的供试液10mL，置无菌离心管中，经500r/min离心5min后，以无菌操作取上清液1mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）100mL中，加入装有直径为50mm、孔径为（0.45±0.02）μm的微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）冲洗滤膜3次，每次50～100mL，取出滤膜，按上述操作分别进行5次，各置5皿，再注入约45℃的TTC营养琼脂培养基约15mL，混匀，37℃培养48h后计数。　　1.

7、2.4试验Ⅱ组分别吸取1∶10供试液10mL置无菌离心管中，经500r/min离心5min后，以无菌操作取上清液1mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）100mL中，加入装有直径为50mm孔径为(0.45±0.02)μm的微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）冲洗滤膜3次，每次50～100mL，最后一次冲洗时同时加入1mL约含50～100个/mL阳性菌菌液，取出滤膜，按上述操作分别进行5次，各置5皿，再注入约45℃的TTC营养琼脂培养基约15mL，混匀，37℃培养48h后计数。　　1.2.5供试品对照组分别吸取1∶10

8、的供试液10mL，经500r/min离心5min后，以无菌操作取上清液1mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）100mL中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为50mm孔径