基因工程药物制备技术

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1、基因工程药物制备技术一、实验目的通过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等基本方法二、实验原理本实验工程菌在含卡那霉素的LB培养基中，在IPTG诱导下可大量表达重组蛋白。重组蛋白以无活性、不溶性的包涵体形式存在。要获得活性蛋白，必须进行变性、复性处理。重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，可与镍进行可逆鳌合反应，因此，可用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进行亲合纯化，以镍柱亲合层析法获得纯化的重组蛋白。工程菌培养破菌诱导表达包涵体制备变性复性重组蛋白纯化（亲和层析）紫外分光光度计检测三、实验器材恒温震荡培养箱、超净工作台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超

2、声波细胞破碎仪、ompW重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等四、实验内容1、实验设计及菌种活化实验整体设计方案的确定培养基及溶液的配制工程菌接种培养配制溶液每组试管、三角烧瓶培养基各一份；PBS全班2升；培养基灭菌后加卡那霉素。菌种活化取菌种接种于10ml的LB培养基中（试管），37℃，190r/min摇床培养过夜。溶液配方1．LB培养基（1L）蛋白胨10g酵母膏5gNaCl10g用NaOH溶液调pH至7.4，高压灭菌。2．卡那/LB液体培养基中，按终浓度50μg/ml加入卡那霉素（母液浓度为0.25g/ml）3．PBS（pH7.4）（1L）NaCL8gKCL0.2gNa2HPO41.44gK

3、H2PO40.24g用HCL调节溶液的pH至7.4，高压灭菌后，保存于室温。2、工程菌的发酵培养及诱导表达实验内容工程菌的发酵培养诱导表达外源蛋白离心收集菌体配制液体实验操作1．摇瓶发酵表达将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37℃，190r/min摇菌培养3～4小时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L（母液0.1mol/L），37℃诱导表达3-4小时。2．菌体收集诱导表达完毕后，4℃10000rpm离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。-20℃保存备用。3．配制包含体洗涤液（明天用）包含体洗涤缓冲液I：包含体洗涤缓冲液II：包含体洗涤缓冲液III：变性液（30

4、0mL)变性液：100MLTris1.2114gEDTA0.0584g2-硫苏糖醇0.154g尿素48.048gHCl调至pH7.5包含体洗涤缓冲液I：（1L）Tris6.057g浓HCl2mLEDTA0.584gNaCl5.85gTristonX-1005mL尿素240.24g包含体洗涤缓冲液II（1L）Tris6.057g浓HCl2mLEDTA0.584gNaCl5.85gTristonX-1003mL包含体洗涤缓冲液III（1L）Tris12.114g浓HCl3mLEDTA0.584g2-硫苏糖醇（DTT）1.54g以下为每升溶液配方3、破菌及包涵体的变性实验内容菌体的破碎包涵体的

5、分离包涵体的洗涤标准曲线的绘制实验操作：（1）悬浮菌体：离心收集的菌体，用50毫升PBS（pH7.4）悬浮菌体。（2）超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率400W，5s/5s,直至溶液变为半透明。（3）收集包涵体沉淀：10000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀。（4）包涵体的洗涤沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液II，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液III，充分混匀。4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清。4、包涵体变性及复性包

6、涵体的变性测变性液蛋白含量复性配制亲和层析缓冲液配制（1）变性将包涵体沉淀按5%（V/V）的稀释度用变性液悬浮，室温静置30分钟，10000rpm离心30min，留上清。（2）用紫外吸收法测变性液蛋白含量利用标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。（3）复性将溶解后的蛋白质150ug/ml稀释（100－200ug/ml），以PBS低温透析，换透析液一次，透析过夜。洗脱缓冲液BNaH2PO46.00gNaCL1.755g咪唑27.23g用高浓度NaOH调pH至8.0。（4）配制亲和层析缓冲液配制（以下为每升配方）平衡缓冲液ANa2HPO41.42gKH2PO

7、40.245gNaCL8.19gKCL0.201g用高浓度NaOH调pH至8.0。介质洗涤液0.5MNaOH5、亲和层析及样品检测亲和层析用紫外分光光度计初步检测样品亲和层析操作（1）样品处理透析液pH用高浓度NaOH调pH至8.0待上样。（2）上样将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的Ni-IDA上。（3）洗涤杂蛋白以平衡缓冲液洗5个柱体积。（4）洗脱以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并收集洗脱液（5）介质清洗用10倍体积0.5MNaOH过柱，