基因工程药物制备的流程

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1、学校代码：10128学号：基因工程药物制备的流程（学生姓名：系别：专业：班级：指导教师：二零一一年九月融合蛋白EGF。E40rf4的表达与纯化1．大规模摇瓶表达刮取平板上的单克隆菌株，接种于20mlYPD液体培养基，28～30。C，200～230rpm振荡培养20h后，将菌液转接于100mlBMG中继续培养过夜，使OD600达到15～18，室温离心15009，收集菌体，重悬于500mlBMMY,振荡培养24h后按最佳诱导条件每天追加甲醇5ml，使甲醇浓度保持在1％。诱导96h后，离心收集上清。大体积培养时，注意保持通气和温度，培养体积不应超过摇瓶容积的1／4，瓶口用四层纱布罩好，控制摇床转速

2、在200—230rpm，温度28～30℃。2．高密度发酵取．80℃保存的菌株，接种于20mlBMG液体培养基，28—30。C，200—230rpm振荡培养20h后，将菌液转接于100mlBMG中继续培养过夜。2LBMG置5L发酵罐内灭菌，用NH40H调pH至6．0，将100ml菌液接种于BMG中，28℃培养，空气泵持续通氧，保持溶氧在30％以上，搅拌转速800rpm左右，约20小时甘油耗尽(表现为溶氧上升)。流加含6mlPTMl微量盐溶液的50％甘油500ml。待甘油流加完毕并且罐内甘油耗竭，补1％酵母提取物和2％蛋白胨以防止蛋白降解，开始流加含12ml／LPTMl的甲醇进行诱导。通过观察溶

3、氧变化调整甲醇流加速度，定期取样测OD600值，镜检监测菌体状态，每12h留取表达上清，诱导3-4天下罐，离心收集上清。3．SDS．PAGE蛋白电泳(1)采用TCA沉淀对表达上清进行浓缩的方法如下：取0．5～1．0ml样品，加入1／10体积100％(W／V)TCA溶液，混匀，冰浴长于30min：44C，12，000rpm，离心15min；弃上清，加入．204C保存的丙酮o．5～1．OrIll，4℃，12，000rpm，离心5min：重复一次；沉淀室温晾干，溶于20—40p11×蛋白上样缓冲液中。(2)SDS．PAGE蛋白电泳：分离胶浓度为15％，含0．375mol／L"Iris，pH8．8，

4、0．1％SDS，0．1％AP,0．04％TEMED；浓缩胶为5％，含0．125mol／LTris，pH6．8，0．1％SDS，O．1％AP,0．1％TEMED。样品100变性3min后上样。在Tris．甘氨酸电泳缓冲液中以50—60V(浓缩胶中)／100～120V(分离胶中)电泳，至溴酚蓝刚出分离胶。4．蛋白质染色硝酸银染色：用5倍于凝胶体积的固定液(50％乙醇，lO％乙酸)固定凝胶上的蛋白质，室温平缓摇动30min以上，用含10％乙醇、5％乙酸的漂洗液洗两次，每次5min；8．3％戊二醛固定10rain；漂洗液洗两次，每次5min；去离子水洗两次，每次5min；加入O．25％硝酸银溶液，平

5、缓摇动15min；用去离子水冲洗两次，每次30sec；加入5倍体积新鲜配制的显色液显色，待蛋白条带达到所需强度，用lO％乙酸终止显色反应。5．Westernblotting(1)转膜：SDS．PAGE蛋白电泳结束后，凝胶于电转缓冲液中浸泡10min，戴手套将硝酸纤维素膜和四张滤纸剪成与胶相同大小，于电转缓冲液中浸5min以上，将凝胶及与之相贴的硝酸纤维素膜夹于四张滤纸、两张网垫及两个多孔塑料板间，将此装置置于电转槽中，令硝酸纤维素膜靠近阳极，4。C，恒压100V，电转l～1．5h。(2)封闭：取下硝酸纤维素膜，置滤纸上吸去多余水分，根据预染标准蛋白标记确定电转移是否成功。明确标准蛋白已从聚丙

6、烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜后，将滤膜移入塑料袋，按O．5ml／cm2加入含5％脱脂奶粉的PBS．T封闭液，封好，室温封闭l一2h。(3)抗原抗体反应：将塑料袋剪一小口，弃去封闭液，按O．1ml／em2加入含有l：500稀释抗人EGF单克隆抗体或1：500兔抗人E40rf4抗血清的封闭液，室温孵育1～2h或4。C过夜。取出滤膜，以TBS．T洗膜，10min／次，三次。将滤膜移入另一新塑料袋，加入用TBS—T稀释的HRP标记的山羊抗小鼠或羊抗兔IgG(1：2000)，室温孵育I-2h，TBS．T洗膜10rain／次，三次，TBS洗膜10rnin，一次。(4)化学发光反应：以O．1ml／cmz将

7、等体积的化学发光试剂A、B液混匀，滴在硝酸纤维素膜上5rain，将膜用保鲜膜包好，根据荧光强度，在X．光底片上分别做不同时间的曝光。曝光后的X．光片依次在显影液、定影液中各浸泡3min。最后，将X．光片用清水冲洗，晾干。6．融合蛋白EGF．E40rf4的纯化采用FPLC系统进行阴离子交换和凝胶过滤柱层析纯化。阴离子交换层析柱：XK26，层析介质：QSepharoseFastFlow，柱体积50Ild；凝胶过滤