生化药物制备 第二章 基因工程制药

《生化药物制备 第二章 基因工程制药》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第二章、基因工程制药第一节、概述现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术。1982年，第一个基因重组产品—人胰岛素在美国问世。基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类：免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足。基因工程技术生产药品的优点：a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；b.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；c.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；d.内源性生

2、理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二节、基因工程药物生产的过程基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。噬菌体遗传学限制酶的发现质粒载体细菌抗药性遗传学噬菌体载体DNA合成与修复细菌基因调节研究外源DNA插入载体动物病毒学细菌表达载体构建基因文库哺乳动物表达载体大规模的蛋白合成克隆特定的基因制备探针反转录病毒和反转录酶m

3、RNA结构与代谢的研究寡核苷酸合成蛋白序列分析小鼠胚胎学插入生殖细胞定点突变改变基因结构功能分析序列分析DNA序列分析RNA序列分析基因工程的诞生与及其相关学科的关系基因工程药物制药的主要程序⒈目的基因的克隆，⒉构建DNA重组体，⒊DNA重组体转入宿主菌，⒋构建工程菌，⒌工程菌发酵，⒍表达产物的分离纯化，⒎产品的检验等。基因工程药物的制备流程基因工程药物生产的基本过程基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。基因工程药物的上游技术：

4、1、基因克隆载体:质粒载体，2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的载体DNA和待克隆的核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。三、目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？目的基因的获取途径：1、逆转录法逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。（1）、mRNApurification（mRNA纯化）a.细胞内RNA的组成和含量:DNA:95%核内，5％细胞器RNA：75％细胞质，10%核内，1

5、5%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%b.真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法。3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAOligo(dT)纤维素Poly(A)--Oligo(dT)100mMNaCl洗脱rRNA/tRNA10mMTris1mMEDTAPoly(A)mRNATotalRNA纤维素柱纯化Poly(A)mRNA流程图（2）、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被

6、拷贝。（3）、cDNA第二链的合成；反应在DNA聚合酶I催化下完成(4)、cDNAcloning；质粒DNA：expressionvectorpUC，pBR322噬菌体DNA:λgt11,λgt11等。基因工程基本过程：双重旋转对称的结构或称回文序列(palindrome)。(5)、将重组体导入hostcell(6)、cDNAlibraryidentification（cDNA文库的鉴定）(7)、目的cDNA克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。）2、反转录—聚合酶链反应法m

7、RNA经反转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA链，用于重组、克隆。3、化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成基因的限制：a.不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆

8、小分子肽的基因。b.人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。c.费用太高。筛选基因的其他方法