《生物药物制备技术》ppt课件

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1、生物药物的制备技术第一节蛋白质类药物的工业生产一、材料的选取来源：动植物组织、微生物等。选取原则：富含蛋白质、容易获得和提取、无害二、蛋白质的提取胞外蛋白质溶媒提取胞内蛋白质破碎细胞溶媒提取超声波、匀浆器等三、蛋白质的分离纯化最常用方法常用NaCl、硫酸铵等盐析法加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。蛋白质一般不变性。有机溶剂沉淀法常用乙醇、丙酮易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。可用于混合蛋白质的分级沉淀。等电点沉淀法选择在pI不变性的蛋白质常联合其它方法使用。根据溶解度分离根据分子大小和形状分离半透膜常用玻璃纸等透析法加入不同浓度的中性盐进行蛋白质的分级沉淀。大分子不可透过

2、半透膜。超滤法超滤膜不同孔径膜易引起蛋白质变性，宜低温进行操作。大分子截留小分子滤过。凝胶过滤法分子筛凝胶葡聚糖凝胶等常联合其它方法使用。大分子受阻小，小分子受阻大。DialysisDialysis透析法凝胶过滤法Gel-FiltrationChromatographyGel-FiltrationChromatography根据电离性质分离蛋白质所带电荷种类、数量及分子大小差异电泳法蛋白质分离和分析的常用方法。醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。离子交换层析法不同蛋白质与离子交换剂结合力大小不同可通过改变溶液pH和盐离子强度分离蛋白质。离子交换纤维素、离子交换

3、凝胶、大孔离子交换树脂等。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）PolyacrylamideGelElectrophoresis等电聚焦电泳IsoelectricFocusingIsoelectricFocusing离子交换层析法Ion-ExchangeChromatography根据配基特异性分离亲和层析法：根据生物分子间亲和吸附和解离的原理而建立的层析法。AffinityChromatography原理：不溶性载体－特异配基＋目的蛋白质，其他蛋白被洗脱掉其它常用分离方法密度梯度离心法ZonalDensityGradientCentrifugation四、蛋白质的分析鉴定Folin-酚

4、试剂法凯氏定氮法双缩脲法紫外分光光度法蛋白质含量测定蛋白质的纯度鉴定方法：层析法、电泳法、免疫化学法、结晶法、等电聚焦法、溶解度分析法等等。常用方法：凝胶层析法、高效液相层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。五、蛋白质类药物的制备示例——白蛋白人血浆[络合]Na2CO3调pH8.6依沙吖啶，静置分离络合物[解离]H2O，HCl调pH弱酸性NaCl，65℃，离心解离液[浓缩]超滤浓缩液[热处理]60℃,10h热处理液[除菌]除菌过滤白蛋白第二节核酸类物质的制备制备途径：从生物材料中提取微生物发酵化学合成一、提取制备大分子DNA的提取制备大分子RNA的提取制备核苷酸的提取制备核苷的提取制备D

5、NP→DNA+蛋白质苯酚法酸水解、碱水解、酶水解浓氨水等剧烈条件二、其它制备方法天然结构物质类似物/聚合物微生物发酵/生物材料提取化学－酶合成法肌苷、鸟苷酸等阿糖胞苷、氟尿嘧啶等超速离心法三、核酸的分离纯化凝胶电泳法柱层析法琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳排阻过滤层析：葡聚糖凝胶/聚丙烯酰胺凝胶分离RNA；琼脂糖凝胶分离DNA离子交换层析：DEAE-纤维素其它：反相层析等_+Agarosemesh凝胶电泳法四、核酸的含量测定方法A260nm＝0.022（1μg/mlRNA）A260nm＝0.020（1μg/mlDNA）（加热条件下）D-核糖＋浓盐酸＋地衣酚绿色（670nm）D-

6、2-脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝色（595nm）有机磷消化→钼蓝660nmRNA:8.5~9.0%DNA:~9.2%第三节酶类药物的工业生产酶在临床上用于疾病治疗已有悠久的历史。由于酶是生理、生化过程的重要参与者，酶量的多少和活性的高低，直接关系到人的健康水平。因此，用酶治疗疾病有着十分广阔的前景。酶类药物获取途径有两种：动植物和微生物直接提取微生物发酵生产酶的制备一般包括四个基本步骤：预处理提取纯化结晶或制剂（一）生物材料的预处理胞内酶要通过破碎细胞把酶释放，再进行抽提酶类提取采用的常用细胞破碎方法有：机械法：利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎物理法：利用温度差、压力差或超声波等

7、将细胞破碎化学法：指利用盐、碱、表面活性剂、ＥＤＴＡ甲醛、丙酮等有机溶剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变酶解法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎冻融法：反复冷冻与融化交替使细胞破碎空气干燥法干燥法　真空干燥法冷冻干燥法（二）酶的提取酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。提取方法：水溶解法、有机溶剂法、表面活性剂法为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中必须注意保