侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放

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1、-侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放中文摘要中文摘要基因治疗就是将外源基因引入受感染的细胞内进行适当的表达，以纠正致病基因所产生的缺陷，从而达到从根本上治疗疾病的目的。目前实施基因治疗的主要瓶颈是缺乏安全高效的基因传递系统。尽管病毒载体具有较高的转染效率，但存在制备复杂，有安全隐患，包装容量有限等问题。因此，近年来人们越来越青睐于人工合成的非病毒载体。由于阳离子聚合物作为非病毒性载体有安全性好、制备简单方便、可多次重复使用等众多优点而受到研究者们的青睐。其中，聚乙烯亚胺(PEI)因其正电荷密度较高，

2、且可通过“质子海绵作用”逃离内涵体，以其结构为基础的新型阳离子聚合物载体成为研究热点。25kDa支化PEI是迄今为止转染效率最高的阳离子聚合物载体之一，现已经被作为新开发的体外转染载体的比较标准，但其跟病毒性基因载体相比转染效率仍然较低且在体内不可降解，细胞毒性较大。本论文研究的主要目的在于对转染效果较好的基因载体25kDa支化PEI进行改性，引入在细胞内可还原降解的二硫键，制备出新型可降解的聚乙烯亚胺(PEI)衍生物作为基因载体，从而实现高效低毒的非病毒基因转染。25kDa支化PEI首先分别与单体Ac-Cys-tB

3、oc及单体MAc-Cys-tBoc进行迈克尔加成，然后脱保护形成取代度分别为14、27、34和13、19、38的PEI-Cys衍生物，并分别命名为PEI-(Cys)x(Ac)和PEI-(Cys)x(MAc)。随后对这些聚合物进行了一系列的性能表征。缓冲能力测试表明所有PEI-Cys衍生物的缓冲能力都比25kDa支化PEI高（21.2-23.1%比15.1%）；凝胶电泳结果表明胱胺的修饰有利于聚合物更好的压缩DNA，PEI-(Cys)x(Ac)在N/P≥5/1时可以将DNA压缩为80-90nm的小粒子，比聚合物25kD

4、a支化PEI压缩的复合物粒径小（100-130nm）。与之对比，聚合物PEI-(Cys)x(MAc)压缩DNA形成的复合物粒子则较大（100-180nm，N/P从30/1到5/1）；凝胶电泳及动态光散射（DLS）测试表明PEI-Cys衍生物与DNA形成的复合物在10mM二硫苏糖醇（DTT）的溶液中可以快速地释放出质粒DNA；与25kDa支化PEI相比所有的PEI-Cys衍生物都具有更低的细胞毒性（IC50:>100mg/Lversusca.11mg/L）；报告基因pGL3在HeLa细胞和293T细胞中的体外基因转染实

5、验表明，随着取代度（DS）的提高，PEI-CysI---中文摘要侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放衍生物的转染效率逐渐降低，而且在相似取代度的前提下聚合物PEI-(Cys)x(MAc)比聚合物PEI-(Cys)x(Ac)的转染效率高。在无血清和有血清条件下，聚合物PEI-(Cys)14(Ac)及PEI-(Cys)x(MAc)与DNA在N/P比为10条件下形成的复合物的转染效率都明显高于25kDa支化PEI（最高达4.1倍）。结果表明经胱胺修饰的可还原降解的新型PEI载体有较好的发展前景，可望被成功研

6、制为既高效又安全无毒的新一代非病毒性基因转染试剂，应用于体内外基因转染。关键词：基因转染；聚乙烯亚胺；复合物；质粒DNA；生物降解；双硫键作者：王玉合指导老师：钟志远教授II---BranchedPolyethylenimineDerivativeswithReductivelyCleavablePeripheryforSafeandEfficientInVitroGeneTransferAbstractBranchedPolyethylenimineDerivativeswithReductivelyCleavab

7、lePeripheryforSafeandEfficientInVitroGeneTransferAbstractGenetherapyisabroadtermthatencompassesanystrategytotreatadiseasebyintroducinganexogenousgeneintocellsofanaffectedperson.Thesafeandeffectivedeliveryoftherapeuticgenesremainsacriticalbottleneckinthefieldofg

8、enetherapy.Althoughviralvectorshavedemonstratedhightransfectionefficiencies,theirsafety,sophisticatedproductionandlimitedgene-encapsulationcapacityremainissuestobesolved.The