胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶c的表达及活性论文

《胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶c的表达及活性论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性论文.freele;gastriccancer;mul-tidrugresistanceAbstract:AIMToobservetheexpressionandactivityofclassicproteinkinaseCingastriccancercellSGC7901anditsdrug-resistantsublinesSGC7901/VCRslectedbyvincristineofdifferentconcentration（0.3，0.7and1.0μgmL-1）.Toexplore

2、theeffectofclassicproteinkinaseCondrugconcen-trationinedbyimmuno-fluorescentmethodandI1640培养液中，37℃，50mLL-1CO2的条件下培养，耐药细胞培养液中分别加入0.3，0.7和1mgL-1长春新碱以维持耐药表型，用于实验前耐药细胞在不加长春新碱的培养液中培养2LL-1H2O2室温15min，水洗3次;3mLL-1TritonX-100室温15min，吸去不洗;1∶10的血清封闭30min，吸去不洗;分别加兔抗人多克隆抗体PKCα（2mgL-1），

3、PKCβⅠ（2mgL-1），PKCβⅡ（4mgL-1）及PKCγ（4mgL-1），37℃孵育1h，PBS洗3次;加羊抗兔IgG-FITC（1∶60），37℃孵育1h，PBS洗3次，用500mLL-1的缓冲甘油封片.实验同时设PBS或无关抗体为替代一抗的阴性对照.1.2.2SF和10gL-1NP-40］裂解细胞制备细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度;取150μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上，丽春红S染色并标记蛋白分子质量标准;去离子水漂去丽春红后以50gL-1脱脂奶粉于室

4、温1h封闭滤膜，常规分别结合兔抗人PKCα，PKCβⅠ，PKCβⅡ及PKCγ多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，最后以DAB显色目的条带.1.2.3PKC活性检测参照文献［5］并进行改良取对数生长期的耐药细胞系、耐药亚系及药敏细胞系，用2.5gL-1的胰酶消化传代于10cm的培养皿中，至对数生长期，冷PBS冲洗2次后，用细胞刮收取细胞，加BufferA1mL（Tris/EGTA/EDTA，β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂），用超声粉碎机粉碎，每次20s，共3次，然后1000g离心15min，沉淀部分超声粉碎后12000g离心10min，

5、所得上清为细胞核部分;上清100000g4℃离心1h，所得上清为细胞质PKC部分;所得沉淀部分加含10mLL-1TritonX-100的BufferA抽提细胞膜PKC30min，每10min震荡1次，然后进行超声粉碎.蛋白定量用Bradford法，活性检测步骤按试剂盒要求进行，所测活性为cPKCs的总活性，PKC比活性用nmolg-1min-1表示.1.2.4流式细胞仪检测细胞内药物浓度参照文献［6，7］进行.取对数生长期细胞用2.5gL-1胰酶消化成单细胞悬液，接种6孔板并继续培养48h.加阿霉素至终浓度为5mgL-1，继续培养1h，冷P

6、BS洗3次，用细胞刮收获细胞离心，再以冷PBS重新悬浮，保存于4℃，上流式细胞仪检测.激发波长为488nm，接收波长为575nm.统计学处理:用方差分析.2结果2.1免疫荧光化学PKCα在耐药细胞系SGC7901/VCR表达呈强阳性，在药敏细胞系SGC-7901表达呈阳性;PKCβⅠ及PKCβⅡ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性.2.2r80000～90000.cPKCs亚型分布有明显的组织特异性，如胰腺表达PKCα，PKCβⅡ，而无PKCβⅠ及PKCγ的表达;肾上腺皮质和髓质细胞表达PKCα，而间

7、质细胞表达PKCβⅠ和PKCγ;人白血病细胞表达PKCα，PKCβ和PKCγ.不同PKC亚型选择性器官分布提示它们在功能上的差异，多种亚型可在同一组织甚至同一细胞中存在，并介导不同的信号传递功能.我们观察了cPKCs在胃癌耐药细胞系及其药敏细胞系的表达［8］，PKCα在耐药细胞表达呈强阳性，在药敏细胞表达呈阳性;PKCβⅠ，PKCβⅡ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性.蛋白印迹实验证实，随耐药指数的增加，PKCα的表达呈逐渐增高的趋势，而PKCβⅠ，PKCβⅡ及PKCγ在耐药细胞及药敏细胞的表达无明

8、显差异.提示PKCα在维持胃癌细胞的耐药表型中可能起重要作用.有研究表明，在体外建立的耐药细胞株，较相应的敏感株蛋白激酶C活性明显增高［9］.近年来也有研究表明耐药细胞系PKC的