胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶c的表达及活性

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1、胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性　　摘要:目的观察传统型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR1.0、耐药亚系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7及药敏细胞系SGC7901表达及活性的变化，以及对细胞内药物浓度的影响.方法用免疫荧光化学及蛋白印迹方法观察传统型蛋白激酶C在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系的表达;竞争蛋白结合法测定PKC的活性;应用流式细胞仪观察细胞内药物浓度的变化.结果PKCα，PKCβⅠ，PKCβⅡ及PKCγ在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系均有表达，PKCα在耐药细胞表达呈强阳性，在药敏细胞表达呈阳性

2、;PKCβⅠ及PKCβⅡ在耐药细胞及药敏细胞表达均为阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均为强阳性.免疫蛋白印迹实验证实，随耐药指数的增加，PKCα表达呈逐渐增高的趋势，薄层扫描蛋白印迹带的吸光度（A）分别为9584.17，9421.06，8534.64，8088.79，而PKCβⅠ，PKCβⅡ及PKCγ在耐药细胞系、耐药亚系及其药敏细胞系表达无明显变化.PKC活性检测结果提示，随耐药指数的增加，PKC活性呈逐渐增高的趋势，以细胞质及细胞核的PKC活性增高为主.结论传统型蛋白激酶C在维持胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR的多药耐药中起重要作用且具有同工酶特异性

3、.　　Keye;gastriccancer;mul-tidrugresistance　　Abstract:AIMToobservetheexpressionandactivityofclassicproteinkinaseCingastriccancercellSGC7901anditsdrug-resistantsublinesSGC7901/VCRslectedbyvincristineofdifferentconcentration（0.3，0.7and1.0μg・mL-1）.Toexploretheeffectofclassicprotein

4、kinaseCondrugconcen-trationinedbyimmuno-fluorescentmethodandI1640培养液中，37℃，50mL・L-1CO2的条件下培养，耐药细胞培养液中分别加入0.3，0.7和1mg・L-1长春新碱以维持耐药表型，用于实验前耐药细胞在不加长春新碱的培养液中培养2L・L-1H2O2室温15min，水洗3次;3mL・L-1TritonX-100室温15min，吸去不洗;1∶10的血清封闭30min，吸去不洗;分别加兔抗人多克隆抗体PKCα（2mg・L-

5、1），PKCβⅠ（2mg・L-1），PKCβⅡ（4mg・L-1）及PKCγ（4mg・L-1），37℃孵育1h，PBS洗3次;加羊抗兔IgG-FITC（1∶60），37℃孵育1h，PBS洗3次，用500mL・L-1的缓冲甘油封片.实验同时设PBS或无关抗体为替代一抗的阴性对照.　　1.2.2SF和10g・L-1NP-40］裂解细胞制备细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度;取150μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上，丽春红S染色并标

6、记蛋白分子质量标准;去离子水漂去丽春红后以50g・L-1脱脂奶粉于室温1h封闭滤膜，常规分别结合兔抗人PKCα，PKCβⅠ，PKCβⅡ及PKCγ多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，最后以DAB显色目的条带.　　1.2.3PKC活性检测参照文献［5］并进行改良取对数生长期的耐药细胞系、耐药亚系及药敏细胞系，用2.5g・L-1的胰酶消化传代于10cm的培养皿中，至对数生长期，冷PBS冲洗2次后，用细胞刮收取细胞，加BufferA1mL（Tris/EGTA/EDTA，β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂），用超声粉碎机粉碎，每次20s，共3次

7、，然后1000g离心15min，沉淀部分超声粉碎后12000g离心10min，所得上清为细胞核部分;上清100000g4℃离心1h，所得上清为细胞质PKC部分;所得沉淀部分加含10mL・L-1TritonX-100的BufferA抽提细胞膜PKC30min，每10min震荡1次，然后进行超声粉碎.蛋白定量用Bradford法，活性检测步骤按试剂盒要求进行，所测活性为cPKCs的总活性，PKC比活性用nmol・g-1・min-1表示.　　1.2.4流式细胞仪检测细胞内药物浓度参照文献［6，7］进行.取对数生长期细胞用2.5g

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