抗原处理与提呈相关基因在重症肌无力患者胸腺组织表达的分析

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1、-------摘要抗原处理与提呈相关基因在重症肌无力患者胸腺组织表达 的研究硕士学位申请人：梁玉推荐导师：杜英教授郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室教研室河南郑州450001摘要研究背景与目的抗原处理与提呈在特异性免疫应答中发挥重要作用，抗原处理与提呈不仅能启动特异性T细胞应答和B细胞应答，也是决定特异性免疫应答类型的重要因素。发挥抗原处理与提呈功能的细胞被称为抗原提呈细胞（antigenpresentingcells，APCs），其中树突状细胞（dendriticcells，DCs）、单核吞噬细胞和B细胞为专职APCs（profe

2、ssionalAPCs），上皮细胞、内皮细胞和靶细胞等被称为非专职APC（non-professionalAPCs）。抗原处理与提呈也在胸腺组织中发生。胸腺组织中存在胸腺上皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞等胸腺基质细胞，它们构成T细胞在胸腺成熟的微环境，这些细胞表面表达MHC-I类分子和MHC-II类分子，也存在与抗原摄取和提呈相关的模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）、补体受体（complementreceptor，CR）、协同刺激分子（co-stimulatingmolecular）等，这些细胞也能

3、分泌多种细胞因子。这些细胞正是通过其膜表面分子、及其释放的细胞因子等因素影响T细胞在胸腺的分化成熟过程，影响不同T细胞亚群的成熟。重症肌无力（myastheniagravis，MG）是T细胞依赖性自身免疫性疾病，多数（80%以上）患者存在胸腺增生、胸腺瘤等异常表现。T细胞在胸腺分化成熟过程中，需要与胸腺皮质上皮细胞、胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞相互作用，经历阳性选择、阴性选择后获得MHC限制性和自身耐受性，才能分化为成熟的功能性T细胞，到达外周发挥重要的免I-----------万方数据-----------摘要疫学作用。阳性选择和阴

4、性选择的重要机制就是胸腺上皮细胞和胸腺树突状细胞的抗原提呈作用。因此探讨重症肌无力患者胸腺组织中树突状细胞及与抗原提呈相关基因的表达有助于揭示MG患者T细胞异常分化的机制，为临床疾病的诊治打下基础。1材料与方法1.1胸腺组织RNA抽提取50mg去筋膜、血污后的胸腺组织，加入ImLTRIZOL试剂，用匀浆器反复研磨制成匀浆。将匀浆置室温（15到30℃）孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆中加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s再置室温孵育3min。4℃12,000g离心15min。小心吸取水相，并将其转移至新管

5、中。向水相中以1mlTRIZOL试剂加0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，室温孵育10min，4℃12,000g离心10min。去上清，加入1ml75%乙醇，清洗RNA沉淀。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10min。加入不含RNA酶的水，反复吹打，60℃孵育10min使RNA溶解。-70℃保存。1.2RNA纯化及质量检测按照产品说明书将RNA溶液过柱（RNeasyMinEluteSpinColumn）、洗脱，获得纯化RNA。紫外吸收测定法检测RNA纯度：用A260/A280的比值检测RNA纯度。变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度：制作

6、1%变性琼脂糖凝胶，取0.5µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70°C孵育5分钟使样品变性。上样后，5–6V/cm电压下电泳。紫外透射光下观察、拍照。1.3cDNA合成取1.5µgRNA，加入500ng/µloligo（dT）1µL，10mMdNTPsMix1µL，最后加灭菌水至13µL。混匀后，置65℃5min冰上1min，短促离心后向离心管中依次加入5×First-StrandBuffer4µl、0.1MDTT1µl、RNaseInhibitor1µl、SuperScriptI

7、IIRT1µl。混匀，50°C温育60min，70°C15min使酶失活。每20µlcDNA加91µl灭菌水混匀，-20°C保存。II-----------万方数据-----------摘要1.1实时定量PCR取已稀释的cDNA102µL，加入2×SuperArrayPCRmastermix550µL，ddH2O448µL。打开PCRArray上的膜、加10ul混合液到PCRArray对应的每个孔中，小心盖上盖子密封PCRArray，在设置PCR程序前将准备好的PCRArray放在冰上，实时定量PCR程序设置完后，将PCRArray置于实

8、时定量PCR仪进行PCR反应。步骤如下：聚合酶激活、变性95℃，10min；95℃15s、60℃1min，扩增40个循环。收集荧光，进行溶解曲线分析。1.2数据分析与统计学分析采用ΔΔCt方法