中国美利奴绵羊MHC Class I区段429P24 BAC克隆序列组成与结构分析

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1、-中国美利奴绵羊MHCClassI区段429P24BAC克隆序列组成与结构分析姓名：李刚（生物化学与分子生物学）指导教师：高剑峰教授摘要目的：研究绵羊MHCclassI区段基因组成旨在寻找并研究与重要经济性状紧密相关以及与绵 羊对疾病的感抗性相关的基因。以美利奴绵羊BAC文库中含有MHC片段的429P24 BAC克隆为材料通过酶切末端标记制备放射性探针,与已构建的cDNA文库进行原位杂 交以筛选含有MHCclassI区段基因序列目的克隆,通过对目的克隆测序及生物信息学分 析,研究429P24BAC克隆中基因的组成与结构。方法：1.从中国美利奴绵羊B

2、AC文库中挑取MHCClassI区段的429P24BAC克隆，培养，送 北京华大基因测序，将测得的序列用Genscan1.0真核生物软件来进行基因预测，进而对预测的信息进行分析，将序列与NCBI上的数据库资源进行比对，获得相关的注释信息。2.对美利奴绵羊BAC文库429P24BAC克隆进行测序,将其酶切后通过末端标记制备成 具有放射性的探针,通过噬菌斑原位杂交筛选构建好的cDNA文库,放射自显影获得目的克隆,并对目的克隆测序及进行生物信息学分析,研究429P24BAC克隆中基因的组成与结构。结果：1.测序结果表明该克隆长度为182KB，将测得的序列

3、用Genscan1.0真核生物软件进行基因预测，结果显示该克隆有13个基因，这13个基因长度都在1，000bp以上。再将序列与GENEBANK上的序列进行比对，获得注释信息显示其序列大多与牛的序列的同源性较高。2.以429P24BAC克隆为探针,筛选出的7个阳性克隆,经初步分析,这7个基因中有1个与 已知的绵羊MHCClassI区段基因有较高的同源性,2个基因与绵羊细胞色素氧化酶基因和热休克蛋白基因有较高的同源性，另外2个基因与牛的序列有较高的同源性，剩余的两个基因与人的染色体17和鼠的序列有一部分同源性，所得到的基因可能与绵羊的免疫与疾病有关。-

4、--1.通过所得的基因序列与429P24BAC克隆序列比对，结果表明所得的基因确实是中国I---美利奴绵羊MHCClassI区段的基因。结论：1.现在生物研究很大程度上已经脱离不了生物信息学，采用生物信息学的方法，可以为我们更好的进行研究，在遇到很复杂的实验问题，尤其在基因组序列组成与功能研究方面，生物信息学更是占有重要地位，实验结果也显示用生物信息学的方法可以更有效的，更快捷的得到表达基因，而且方法比较简单，技术比较成熟。2.噬菌斑原位杂交，在库与库的杂交中，这种杂交是比较可行的，尤其是在研究一些丰度比较低的表达基因，这种方法以其灵敏度高，操作也

5、比较简单，周期短等优点，而受到许多研究者的青睐，从本课题研究结果来看，这个方法也是切实可行的。关键词：32P标记；中国美利奴绵羊；MHC；cDNA文库；DNA探针---II---AnalysisontheGeneComponentandConstructionoftheFragmentin 429P24ofChinaMerinoMHCClassIsectionBACClonePostgraduate:Ligang(BiochemistryandMolecularBiology)Supervisor:Pro.GaoJian-fengAbstractO

6、bjective:StudyofsheepMHCclassIgenescomposedofsectionsdesignedtofindandresearchandan importanteconomictraits,aswellaswiththesheepiscloselyrelatedtothesenseof resistancetodisease-relatedgenes.The429P24BACclonewhichcontainsgenesinovine MHCIregionwillbecutintofragmentssmallerthan2

7、500bpbyrestrictionenzymeBsaJI andendlabeledwith[α-32P]dCTP.Theseradioactivelabeledfragmentscanbeusedas probestohavehybridismwithcDNAlibrary.PositivecDNAcloneswillbemarkedby radioautographyandwecouldgetinformationandanalysisofinsertsinthesepositiveclones bysequencinganddataanal

8、ysisinmolecularbiology.Methods:1.PickuptheChinaMerinoOvisarie