鸭mhc+class+i+cdna分子克隆及其多态性与基因组结构

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1、鸭MHCclassIcDNA分子克隆及其多态性与基因组结构夏春+林常有+徐广贤胡ttl军杨天耀(中国农业大学动物医学院，北京100094)综述[摘要]从北京鸭cDNA文库中克隆了鸭MHCclassI基因(AnplMHcI)，并对其等位基因多态性、基因组结构、以及多肽结台区(PBD)的氨基酸置换率和三级结构进行了量化分析。Anpl—MHCI长I，098个核苷酸，编码356个氨基酸}基因组DNA由8个外显子和7个内古子组成。AnplMHCI等位基因可分为4个类型(一UA～--UD)。在其a1和a2区有28个高置换位点，并存在重组杂合现象

2、。AnplMHcI氨基酸序列中保留了HLA--A2与抗原多肽结合的8个关键性氨基酸；相互闻同源率为83．6％～88．5％．与鸡(B21，B2．Y)同源率为57．3％～64．6％；与人和鼠的同源率为40．3％～42．8％．即AnplMHCI比鱼类、蛙、鸡更接近于人类MHCclassI序列。RT—PCR检测到Anpl—MHCl在脑、心、肾、脾、肠和法氏囊中表达。与人HLA—A2晶体结构比较，AnplMHCI在4个区有缺失或插人变异，其n螺旋和p折叠区相对保守。MHCclass1分子系统树也进～步揭示了鸭与鸡，与鱼类、两栖类、哺乳动物以及

3、人类的进化关系。[关t词]鸭}MHCclassIl抗原多肽结合区÷基因组}多态性}分子系统树主要组织相容性复合体(MHC)指连锁于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群口1。此基因群决定了种群和个体的免疫应答差异，并与疾病的抗性密切相关⋯。MHC分为MHCclassI和MHCclassII，MHCclassI由q1，d2，a3链，跨膜区(TM)和胞质区(CY)组成，分子量约45kD。其a1与砣链通过a螺旋和p折叠形成多肽结合区(PBD)，PBD与抗原多肽结合后、被T细胞受体(TCR)识别，由此引导细胞性免疫应答o

4、“o。迄今为止，人和高等脊椎动物MHC的研究已十分清楚。如人MHCclassI(HLA)具有6个基因座，266个以上的等位基因口’⋯。而低等脊椎动物MHC的研究尚处于拓展状态。1988年，Bourlet等率先克隆了鸡MHCclassI基因“3。1990年，Hashimoto等克隆了鲤鱼MHCclassI基因[“。随后，蛙‘“，蝾螈⋯和鱼类MHC基因口’”也被陆续克隆。我们也曾报道过草鱼和虹鳟鱼MHC的分子结构o””]。这些研究中，令人注目的是鸡MHC的研究与群发病控制的关系，即鸡MHC基因座和单模型与病毒性疾病“4’”3以及与抗体产

5、生动力学的关系口“。这类研究使经济动物MHC的研究进入了实用阶段。鸭(Anasplatyrhynchos)是养殖规模最大的水禽，在我国年养殖量约30亿羽。鸭有数十种疾病，但是，有关鸭分子免疫系统的报道甚少。为了阐明鸭MHCclass1分子结构，本研究以北京鸭为材料，从eDNA文库中克隆了鸭MHCclassI基因(Anpl～MHcI)，并对其基因组结构、等位基因多态性以及抗原多肽结合区(PBD)的氨基酸置换率和三级结构进行了量化分析。1材料与方法1_1核酸抽提与单链cDNA合成采用Trizol试剂(GibcoRBL)从脑、心、肾、脾、

6、肠和法氏囊中提取总RNA。参照夏春等方法。钉从肝组织中提取基因组DNA。以总RNA为模板、P15T(5’CTGATCTAGAGGTACCGGATccTTTTTTTTTTTTTTT37)为反转录引物、采用First—StrandeDNASynthesisKit(PharmaciaBiotech)分别合成各脏器first—strandcDNA(fcDNA)。1．2种闻交叉PCR如图1所示，从DDBJ／EMBL／GenBank基因库中读取人、鼠、鸡和蛙的MHCclassI基因序列，采用GENETYX9．0软件(SoftwareDevelo

7、pmentCO．，LTD)排列其q2区域，在形成二硫键的两半胱氨酸外侧区域20039一18收稿*同等贡献者，通讯作者，E圳l；xiachun@⋯edu．cnTEL86—10—62893372——839史鱼查笪量匿堂叁鱼塑兰坌盒塑±三达芏查堑过盒鲨塞塞分别设计引物。正引物序列(s96)为5’--CARHNGATGTAYGGNTGT一3’，反引物(ASl64)序列为5，一YTTNARCCAYTCNATRCA3’，其中N代表A、T、G或C；Y代表T或c；R代表G或A。PCR条件为94"C变性1min，52V退火1rain，68℃延伸1ra

8、in，35个循环后72℃10rain。随后，参照夏春等⋯1方法进行克隆与测序。克隆片段命名为Anpl—MHcIa2CC。m』^2K02：883：GsHT、q岫∞ⅡvGs肿啪YII州^Y阱札ⅣI^l脚L路瓢MD■Mq订踟静●B^^IIv