淀粉样肽诱导红细胞膜损害的作用

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1、淀粉样肽诱导红细胞膜损害的作用ok3mol/L分别降至80.7mmol/L和76.9mmol/L.结论:在本实验条件下,γ射线辐照可降低Aβ对红细胞膜的损伤,并可增加红细胞膜的流动性及稳定性.【关键词】γ射线;淀粉样β蛋白;红细胞;溶血;膜流动性0引言低剂量γ射线辐照(<1Gy)可刺激机体的免疫功能,提高机体的抗病能力[1].目前,临床上常用15~35Gy的γ射线对血液进行辐照,灭活血液中的淋巴细胞,以预防输血相关的免疫疾病[2].该剂量范围的γ辐射对血液中的其他成分也可产生一定的影响[3-4].红细胞在经400

2、Gy辐照后,短时间内可增加细胞的稳定性[5].本研究采用小于100Gy的γ射线处理红细胞,以β淀粉样肽(βamyloidpeptide,Aβ)诱导红细胞膜损害为实验模型,研究此剂量范围的辐射对红细胞某些性质的影响,以及对Aβ的细胞毒性的作用.1材料和方法1.1材料新鲜全血取自健康志愿者,枸醛酸抗凝;Aβ和荧光探针1,6二苯基1,3,5己三烯(diphenylhexatriene,DPH)(美国SigmaAldrich公司);其它试剂均为国产分析纯.1240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);LS55型荧

3、光分光光度计(美国PerkinElmer公司);3k30型冷冻离心机(美国Sigma公司);GammacellR1000型血液辐照仪(加拿大Nordian公司);Quanta200型环境扫描电镜(荷兰PhilipsFEI公司).1.2方法1.2.1红细胞的制备和辐照处理取新鲜全血750g,4℃离心10min,吸去上层血浆和白细胞,并用等渗PBS(150mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,10mmol/LNa2HPO4,2mmol/LNaH2PO4,pH7.4)洗涤3次,制备成200mL/L细胞悬液,然

4、后用γ射线照射,照射剂量分别为0,50和100Gy.1.2.2红细胞溶血率的检测照射过后的红细胞悬液用等渗PBS稀释至20mL/L,加入Aβ使其终浓度为5mg/L,37℃水浴30min后取出,750g,4℃离心10min,取上清,540nm处测出吸光度值A1;沉积红细胞用蒸馏水全溶血后离心,用同样方法测得吸光度值A2.按下式计算溶血率:溶血率(%)=A1/(A1+A2)×100%.1.2.3扫描电镜观察红细胞形态处理过的红细胞经终浓度为10g/L戊二醛固定,用500,700,900,1000mL/L丙酮系列脱水,喷金后

5、进行扫描电镜观察.1.2.4红细胞的渗透脆性测定红细胞分为未照射组,50Gy照射组和100Gy照射组.配制不同渗透压的PBS,其中NaCl的浓度为0~135mmol/L,在上述PBS中分别加入各组红细胞悬液,细胞终浓度为2mL/L,37℃水浴30min,取出后以1.3.2中的方法分别测溶血率,以NaCl浓度分别为135mmol/L和0mmol/L的PBS为对照和全溶血对照,计算50%溶血时的NaCl浓度.1.2.5红细胞膜流动性的检测用四氢呋喃作溶剂配制2×10-3mol/L的DPH储存液,于棕色瓶中4℃低温保存.工作

6、液浓度为5×10-5mol/L,临用前用等渗PBS稀释.红细胞用等渗PBS稀释至2mL/L浓度,与DPH工作液等体积混合,于37℃水浴孵育45min后,检测偏振荧光(激发光波长为362nm,发射光波长为450nm).统计学处理:用SPSS10.0统计软件进行处理,实验数据以x±s表示,多个样本均数比较采用方差分析及t检验.2结果2.1红细胞的溶血率在未经辐照处理的情况下,等同实验操作可使红细胞发生少量溶血(溶血率<4%),而在红细胞经γ射线照射后,自然溶血率随着辐照增加而降低,在100Gy时自然溶血率由(3.76

7、±0.50)%降至(1.87±0.09)%,差异具有统计学意义(P<0.05).加入Aβ后可导致红细胞溶血率增高至(11.90±1.50)%(P<0.01),红细胞经γ射线照射后,Aβ导致的溶血作用降低,50Gy照射组虽低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),而100Gy辐照则使Aβ的溶血作用降低至(7.90±0.90)%,其差异具有统计学意义(P<0.05).2.2红细胞形态未经γ射线辐照的红细胞,Aβ处理后形态发生明显改变,部分细胞出现棘突,并伴随有细胞的轻度聚集;经过γ射线照射后,

8、Aβ处理的红细胞中变形的细胞比例减小,聚集程度相对降低,形态维持较好.说明γ射线照射对红细胞维持正常形态有一定的作用(图1).A:对照组;B:未加入Aβ,辐照剂量为50Gy;C:未加入Aβ,辐照剂量为100Gy;D:未经辐照处理的RBC加入Aβ;E:加入Aβ,辐照剂量为50Gy;F:加入Aβ,辐照剂量为100Gy.图1红细胞形态的