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1、可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建作者：徐颖,田玉科,田学愎,梅伟,安珂,杨辉【关键词】可诱Constructionofanimmortalizedratastrocytestrainmortalizedratastrocytestrain(IAST)expressingenkephalinregulatedbyDoxycycline.METHODS:Humanpreproenkephalingene(hPPE)idpRevTREtoconstructrebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPE.pRevTetOnandpR
2、evTRE/hPPEid.OneIAST/TetOnclonemunocytochemistryandindirectimmunofluorescencestaining.RESULTS:ArebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPEultipleoftheIAST/TetOncellstrainmunocytochemistryconfirmedthatenkephalinexpressionlevelanner.CONCLUSION:AnIASTanpreproenkephalin;geneexpressionregulatio
3、n;polyomavirustransforming;astrocyte【摘要】目的：构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株（IAST）.方法：应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因（hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒（pRevTRE/hPPE）；以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTetOn分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清；将含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRELuc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/TetOn细胞株；再将
4、RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn细胞株,得到稳定表达脑啡肽的IAST/TetOn/hPPE细胞株,通过RTPCR、免疫细胞化学及间接免疫荧光染色检测该细胞株中强力霉素定量调控脑啡肽的表达.结果：重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE构建成功；经挑选得到了高表达、低背景IAST/TetOn细胞株,其诱导倍数为20.6；在IAST/TetOn/hPPE细胞株中,hPPE基因表达受强力霉素调控,呈剂量依赖关系.结论：成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的永生化IAST,为可调控基因治疗慢性疼痛的研究奠定了基础.【关键词】人
5、前脑啡肽；基因表达调控；多瘤病毒转化；星形胶质细胞0引言转基因细胞移植镇痛为慢性疼痛的治疗开辟了新领域［1］,但传统的转基因镇痛模式不能调控镇痛物质的分泌,外源镇痛基因在宿主体内持续表达可带来诸多不良后果.TetOn基因调控系统通过四环素及其衍生物强力霉素来调节目的基因的定量表达,是在分子水平精确调控外源基因表达的较好工具［2-3］.为安全有效实施转基因镇痛,我们拟运用逆转录病毒四环素调控系统,建立可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株（immortalizedratastrocytestrain,IAST）,并在体外观察强力霉素对脑啡肽表达的定量调节.1材料和
6、方法1.1材料原代培养的永生化IAST系本实验室构建［4］.逆转录病毒载体RevTetOn系统（包括调节质粒pRevTeton、反应质粒pRevTRE、报告基因pRevTRELuc、包装细胞PT67，Tet系统专用血清）购自Clontech公司；表达载体pCMVhPPE(含目的基因hPPE)由美国学者为Invitrogen公司产品.MMLVReverseTranscriptase逆转录酶及萤光素酶分析试剂盒购自Promega公司.亮氨酸脑啡肽多克隆抗体购自美国Chemicon公司.萤光发光计TD20/20为TurnerBiosystem公司产品.1.2方法1.
7、2.1可调控逆转录病毒表达载体的构建根据GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位点设计一对引物,引物两端分别带有BamHⅠ,HindⅢ酶切位点.上游引物：5′CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3′（含有BamHⅠ酶切位点）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3′（含有HindⅢ酶切位点）.以表达载体pCMV/hPPE为模板PCR扩增hPPE基因片段.琼脂糖电泳PCR扩增产物,凝胶回收950bp的hPPE基因片段,用BamHⅠ，HindⅢ双酶切后,与BamHⅠ，HindⅢ线性化的载体pRe
8、vTRE连接,获得重组逆转录病毒载体p
