资源描述：
《可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建论文徐颖,田玉科,田学愎,梅伟,安珂,杨辉【关键词】可诱Constructionofanimmortalizedratastrocytestrainmortalizedratastrocytestrain(IAST)expressingenkephalinregulatedbyDoxycycline.METHODS:Humanpreproenkephalingene(hPPE)idpRevTREtoconstructrebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPE.pRevTetOnandpRevTRE/hPPEid
2、.OneIAST/TetOnclonemunocytochemistryandindirectimmunofluorescencestaining.RESULTS:ArebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPEultipleoftheIAST/TetOncellstrainmunocytochemistryconfirmedthatenkephalinexpressionlevelanner.CONCLUSION:AnIASTanpreproenkephalin;geneexpressionregulation;polyomavirustransform
3、ing;astrocyte【摘要】目的：构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株（IAST）.方法：应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因（hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒（pRevTRE/hPPE）；以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTetOn分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清；将含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRELuc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/TetOn细胞株；再将RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn细胞株,得到稳
4、定表达脑啡肽的IAST/TetOn/hPPE细胞株,.freelmortalizedratastrocytestrain,IAST）,并在体外观察强力霉素对脑啡肽表达的定量调节.1材料和方法1.1材料原代培养的永生化IAST系本实验室构建［4］.逆转录病毒载体RevTetOn系统（包括调节质粒pRevTeton、反应质粒pRevTRE、报告基因pRevTRELuc、包装细胞PT67，Tet系统专用血清）购自Clontech公司；表达载体pCMVhPPE(含目的基因hPPE)由美国学者为Invitrogen公司产品.MMLVReverseTranscriptase逆转录酶及萤光素酶分
5、析试剂盒购自Promega公司.亮氨酸脑啡肽多克隆抗体购自美国Chemicon公司.萤光发光计TD20/20为TurnerBiosystem公司产品.1.2方法1.2.1可调控逆转录病毒表达载体的构建根据GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位点设计一对引物,引物两端分别带有BamHⅠ,HindⅢ酶切位点.上游引物：5′CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3′（含有BamHⅠ酶切位点）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3′（含有HindⅢ酶切位点）.以表达载体pCMV/hPPE为模板PCR扩增hPPE基因片段
6、.琼脂糖电泳PCR扩增产物,凝胶回收950bp的hPPE基因片段,用BamHⅠ，HindⅢ双酶切后,与BamHⅠ，HindⅢ线性化的载体pRevTRE连接,获得重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取质粒DNA,经PCR、酶切分析及DNA序列测定鉴定.1.2.2逆转录病毒载体的包装脂质体（lipofectamine）介导分别将质粒pRevTRE/hPPE，pRevTetOn转染逆转录病毒包装细胞PT67.质粒pRevTeton含有新霉素抗性基因（Neo）,经G418（500mg/L）筛选后,获得稳定产生RevTeton病毒的包装细胞
7、系PT67RevTeton；质粒pRevTRE/hPPE含有潮霉素抗性基因（Hyg）,经潮霉素(500mg/L)筛选后,获得稳定产生RevTRE/hPPE病毒的包装细胞系PT67RevTRE/hPPE.1.2.3萤光素酶活性检测将含有RevTeton病毒上清感染IAST细胞株,经G418(500mg/L)筛选后得到抗性克隆,采用有限稀释法挑选单克隆,共形成48个单细胞克隆,命名为IAST/TetOn,分别编号为No.1～No.48.报告质粒pRevTRELuc和pCM
