药用植物泰山四叶参dna提取方法的研究

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1、药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究史仁玖，王桂龙，宫元伟，郝岗平，王德才【摘要】　　目的探讨不同DNA提取方法对泰山四叶参DNA质量的影响。方法对提取的DNA进行紫外光谱分析、总DNA电泳及RAPD分析。结果不同方法提取的DNA质量及产率存在显著差异。结论结果表明改良CTAB法和改良SDS法较好。【关键词】泰山四叶参基因组DNADNA提取方法　　泰山四叶参CodonopsislanceolataBenth.etHook.，属桔梗科党参属，泰山四大名药之一，以根为药，具有补血通乳、养阴润肺、益胃生津之功效〔1〕。本研究旨

2、在利用RAPD分子标记技术构建不同产地四叶参DNA指纹图谱，为四叶参真伪鉴定提供分子依据。高质量的基因组DNA是获取可靠分子标记结果的前提。泰山四叶参多糖、蛋白含量高，不易去除，从而影响DNA的纯度和浓度。本研究改进了传统的SDS法和CTAB法。采用改良方法所提取的DNA可作为分子生物学研究的模板，这为RAPD分子标记和后续的分子生物学研究奠定了重要基础。　　1器材　　MyCycler梯度PCR仪(Bio-rad公司)，离心机(Sigma3K30)，DNA离心真空干燥器(Savant)。　　泰山四叶参叶片采自泰山药用植物园

3、，贮存于-70℃冰箱备用。CTAB(上海生物工程技术有限公司),SDS(上海生物工程技术有限公司)，PVP(上海生物工程技术有限公司)，β-mercap-toethanol(上海生物工程技术有限公司)，Taq酶(Takara)，RAPDPrimers(Opron公司)。　　2方法与结果　　2.1DNA提取方法及检测结果常规SDS法：参照文献〔2〕操作;常规CTAB法:参照文献〔3〕操作。　　改良CTAB法,　　2.2RAPD实验分析　　DNA质量选择4条不同的随机引物做RAPD试验。随机引物选用美国Opron公司的OpA2

4、18(5＇AGGTGACCGT3＇)、OpC201(5＇TTCGAGCCAG3＇)、OpA167(5＇CGGAGTCGAT3＇)和OpC236(5＇CCGGTCGCTC3＇)用于扩增。RAPD的反应体系为:Taq酶0.04U/μl、dNTP0.30mmol/L、Primer1.0μmol/L、Mg2+1.5mmol/L、模板1.0mg/L,10×PCR缓冲液2.5μl,ddH2O补足25μl。反应程序为94℃预变性4min,94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1min,40个循环,最后延伸1.5min。1.5

5、%琼脂糖凝胶电泳观察、记录。　　RAPD分析表明，4条引物在均可扩增出清晰的条带，有很好的多态性。两种来源DNA扩增条带清楚、结果相似，重复性较好，说明用改良CTAB法和改良SDS法所提取的DNA满足RAPD分析的需要。总体上，CTAB改良法获得的基因组DNA的扩增谱带更清晰，所获得的谱带更丰富，说明此种情况下所获得的基因组DNA的质量最高(见图2)。　　3讨论　　高质量的基因组总DNA是进行各项分子生物学实验操作的基础。泰山四叶参叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多酚和色素类等次生代谢物质，这给DNA的提取带来一定难度。在研

6、究中用常规CTAB和SDS方法提取的总DNA色黄黏稠，含有大量多糖等杂质，常规SDS法提取四叶参基因组DNA的效果最差，A260/A280的比值为1.64；电泳图上有拖尾现象，说明DNA有一定程度的降解；点样孔处最亮，表明该方法去除多糖和蛋白质的效果不好。CTAB是一种阳离子去污剂，能裂解细胞、破坏细胞膜系统、使蛋白质变性，传统CTAB法提取得到的DNA沉淀粘滞性很高，推测是多糖或蛋白质，因为在0.8％的琼脂糖凝胶电泳图上可以看到该方法相对应的点样孔处较亮，但相对传统SDS法，该方法去多糖的效果要好一些。改良SDS法和改良

7、CTAB法要明显优于前两种方法，因为结合四叶参的自身性质，采用核分离液在核裂解之前将存在于细胞质中的次生物质先除去，这样就去除了大部分的次生物质。　　改良CTAB法根据细胞区室化原理，即多糖和多酚类物质及其他杂质与DNA相互隔离的特性，在加CTAB裂解液之前，先用一种能维持细胞核内外渗透平衡的提取缓冲液进行抽提，这样可在细胞核裂解前将细胞间和细胞质中的多糖及酚类杂质去除，避免DNA受大量杂质的污染〔6〕。为了有效地去除多糖和多酚类等物质的干扰，提取缓冲液中除含有维持渗透平衡的葡萄糖外，还加入了2％的可溶性PVP、2％的β-

8、巯基乙醇和1.4mol/L的NaC1。PVP可与酚类物质结合形成水不溶性的复合物〔7〕，β-巯基乙醇可以抑制酚类物质氧化的作用，有效地防止了提取过程中组织褐化现象的产生〔8〕；1.4mol/L的NaC1高盐溶液增加了淀粉在乙醇中的溶解度，从而使DNA优先沉淀，有效去除了淀粉和其他多糖，降低了多糖类物质对