药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究

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1、药用植物泰山四叶参DNA提取方法的研究作者：史仁玖，王桂龙，宫元伟，郝岗平，王德才【摘要】　　目的探讨不同DNA提取方法对泰山四叶参DNA质量的影响。方法对提取的DNA进行紫外光谱分析、总DNA电泳及RAPD分析。结果不同方法提取的DNA质量及产率存在显著差异。结论结果表明改良CTAB法和改良SDS法较好。编辑。【关键词】泰山四叶参基因组DNADNA提取方法泰山四叶参CodonopsislanceolataHook.，属桔梗科党参属，泰山四大名药之一，以根为药，具有补血通乳、养阴润肺、益胃生津之功效［1］。本研究旨在利用RAPD分子标记技术构建不同产地四叶参

2、DNA指纹图谱，为四叶参真伪鉴定提供分子依据。高质量的基因组DNA是获取可靠分子标记结果的前提。泰山四叶参多糖、蛋白含量高，不易去除，从而影响DNA的纯度和浓度。本研究改进了传统的SDS法和CTAB法。采用改良方法所提取的DNA可作为分子生物学研究的模板，这为RAPD分子标记和后续的分子生物学研究奠定了重要基础。1器材MyCycler梯度PCR仪(Bio-rad公司)，离心机(SigmaK30)，DNA离心真空干燥器(Savant)。　　泰山四叶参叶片采自泰山药用植物园，贮存于-70℃冰箱备用。CTAB(上海生物工程技术有限公司),SDS(上海生物工程技术有

3、限公司)，PVP(上海生物工程技术有限公司)，β-mercap-toethanol(上海生物工程技术有限公司)，Taq酶(Takara)，RAPDPrimers(Opron公司)。方法与结果.1DNA提取方法及检测结果常规SDS法：参照文献［2］操作;常规CTAB法:参照文献［3］操作。　　改良CTAB法,参考文献［4］并改进：称取泰山四叶参叶片，液氮研磨成细粉状，加入600μl核分离液［100mmol/LTris-HCl(),0mmol/LEDTA(),00mmol/LNaCl,2%PVP(W/V),2％β-巯基乙醇(V/V)］，迅速研磨成匀浆状，转入的离

4、心管，℃，000r/min离心10min。弃上清，加入600μl预热的CTAB核裂解液［100mmol/LTris-HCl(),50mmol/LEDTA()，/LNaCl,2%CTAB(W/V),2％PVP(W/V)］，6℃水浴保温60min。冷却几分钟后加入600μl氯仿/异戊醇，摇匀室温放置min，10000r/min离心10min，重复抽提1次。取上清，加入1/5体积的mol/L的NaCl，加入2/体积的预冷异丙醇摇匀，室温放置1min后可见白色丝状DNA沉淀析出。室温离心去上清后加入70%的乙醇清洗次，真空干燥后加入200μlTE溶解沉淀，加入RNa

5、seA至终浓度为10μg/ml，3℃水浴保温30min。加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min,室温离心10min，取上清加入1/10体积的mol/LNaAc,混匀后再加入倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min。离心，弃上清，70%的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50μl的TE中，-20℃贮存备用。　　改良SDS法，参考文献［5］并改进：称取四叶参幼叶于预冷研钵中，液氮研磨成细粉状后立即加入600μl核分离液，迅速研磨成匀浆状，小心转入的离心管。℃，000r/min离心10min;弃上清，加入600μl预热的SDS核裂解液，同时洗净管盖及管壁上

6、残留的植物组织，用灭菌牙签轻轻混匀，6℃水浴保温60min，期间不时轻轻摇动离心管几次;冷却几分钟后加入600μl氯仿/异戊醇摇匀室温放置min,10000r/min,离心10min。转移上清，重复抽提1次；取上清，加入1/体积的mol/L的NaCl，混匀,加入2/体积的预冷异丙醇摇匀。℃放置30min，此时可见白色絮状DNA沉淀析出于离心管液相中上部，而细胞碎片及其它杂质沉淀于离心管底部；用灭菌牙签将DNA沉淀挑出，用70%的乙醇漂洗2次，真空干燥后加入200μlTE溶解沉淀，加入RNaseA至终浓度为10μg/ml，3℃水浴保温30min；加入等体积的氯

7、仿/异戊醇，混匀，10000r/min,室温离心10min，取上清加入1/10体积的mol/LNaAc，混匀后再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min;离心，弃上清，沉淀用再70%的冷乙醇清洗2次，真空干燥后溶于50μl的TE中，-20℃贮存备用。　　用%琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定A260/A280的方法判定DNA的质量。　　种方法提取泰山四叶参叶片DNA，结果表明常规SDS法和常规CTAB法提取的基因组DNA样品中蛋白质含量较高，A260/A280比值均小于，样品的浓度较高；改良SDS法和改良CTAB法提取的基因组DNA样品浓度较低，分离的基因

8、组DNA样品中蛋白质含量较低，A260/A280比值