高氧性肺损伤中mapk信号途径的表达及其作用机制

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1、高氧性肺损伤中MAPK信号途径的表达及其作用机制【摘要】目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路三亚族ERK，p38，JNK在大鼠高氧性肺损伤动物模型中的表达及作用.方法：24只3周龄APK蛋白表达变化.结果：高氧暴露3，7d组出现急性肺损伤的典型病理学特征，高氧暴露14d组肺间质及纤维细胞增生明显.免疫组化显示空气对照组仅肺泡上皮细胞及气道上皮细胞见少量磷酸化ERK，p38，JNK阳性表达，高氧暴露组则阳性细胞明显增多，广泛分布于肺内细胞中：肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞、浸润炎细胞及间质纤维细胞,p38

2、阳性表达尤多见于炎性细胞中.APK信号途径，磷酸化ERK，p38，JNK在高氧损伤肺组织表达明显增加，MAPK三亚族ERK，p38，JNK活性变化在时间上并不具有同步性.【关键词】高氧症；急性病；肺/损伤；MAP激酶信号系统；ROS　　氧疗是治疗新生儿呼吸窘迫综合症的有效方法之一，但长时间暴露在高氧状态下会导致肺上皮细胞死亡、急性肺损伤甚至呼吸功能衰竭〔1〕.尽管高氧介导的肺损伤机制目前尚不完全清楚，但已经证实丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPK)信号转导途径与多种氧化应

3、激性疾病密切相关〔2-3〕.我们以幼年APK信号通路中3个主要亚族成员细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK），cJun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK）,p38激酶在不同高氧暴露时间段肺组织的分布以及蛋白表达，并分析MAPK信号转导途径与高氧肺损伤的关系.　　1材料和方法　　1.1材料　　3周龄APK抗体的分布，其余部分置于-70℃冰箱保存，行phosphop44/p42，p38，SAPK/JNKAPK在肺组织中的分布切片脱

4、蜡至水，30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶5～10min，热修复抗原，血清封闭20min，滴加一抗，分别为磷酸化ERK多克隆抗体（1∶250），磷酸化p38多克隆抗体（1∶1000），磷酸化JNK多克隆抗体（1∶100），4℃过夜.二抗为HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃20min孵育.DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞.　　1.2.4肺组织胞浆蛋白提取和定量　　滴加液氮于研钵粉碎组织块，加入改良RIPA缓冲液（TrisHCl50mmol/L，Na

5、Cl150mmol/L,EDTA1mmol/L,NaF50mmol/L,Na4P2O72.5mmol/L，Na3VO41mmol/L，TritonX10010mL/L，甘油100mL/L，SDS1g/L，脱氧胆酸钠5g/L，leupetin100umol/L，PMSF1mmol/L.每100mg组织加入0.5mLRIPA裂解液，充分匀浆，冰浴作用30min,4℃12879g离心30min.此操作过程均在冰上进行以防止蛋白降解.取上层液体-20℃保存.用BCA比色法测定蛋白质浓度.　　1.2.5磷酸化ERK，p38，JNK蛋

6、白含量检测　　用in，用QuantityoneChemiDocXRS图像采集系统及分析软件（美国BioRad公司）对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积（Adjvolume）/GAPDH校正容积（Adjvolume）表示.　　统计学处理：计量数据以x±s表示，采用SPSS11.5分析软件多组间比较用单因素方差分析，两两组间差别比较采用LSDt检验，P＜0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1肺组织病理学观察　　空气对照组肺组织肉眼观无明显异常.高氧暴露3和7d组肺组织体积增大，表面点状或斑片状出血，切

7、面见液体流出，呈充血水肿状；光镜见肺泡上皮细胞肿胀，肺泡腔和肺间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，尤以高氧暴露7d组更明显.高氧暴露14d组肺组织体积较3和7d组略小，肺表面见斑片状改变，光镜下肺泡上皮水肿减轻，炎性渗出减少，肺间质及纤维细胞增生明显.　　2.2磷酸化MAPK蛋白在肺组织的分布　　空气对照组偶有少量磷酸化ERK，p38，JNK阳性表达，主要见于肺泡上皮细胞及气道上皮细胞，高氧暴露组则阳性细胞明显增多，广泛分布肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞以及浸润炎症细胞、支气管黏膜下水肿间质的纤维细胞.p38尤其

8、高表达于大量浸润炎性细胞.三种MAPK蛋白表达的细胞类型基本相同(图1).　　2.3肺组织磷酸化ERK/p38/JNK蛋白含量变化　　与空气对照组比较，各高氧暴露组ERK/p38/JNK蛋白表达明显增强.phosphoERK，phosphoSAPK/JNK在高氧暴露7d组表达最为明显（