高氧肺损伤中肺细胞凋亡及jnk信号通路调控机制论文

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1、高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制论文胡兰，许峰，李静，方芳，匡凤梧，王兴勇，卢仲毅【摘要】目的：观察高氧暴露下肺组织细胞凋亡和磷酸化cJun氨基末端激酶（pJNK）蛋白表达的变化，并探讨JNK信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制.方法：48只3inalkinase，JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(motigenactivatedproteinkinases，MAPKs)家族中的重要通路之一［4］，其在体内是否参与了高氧肺损伤的发病机制并介导高氧诱导的肺细胞凋亡，目前还少见报道.我们以幼年2000B，记数每个视野的凋亡指数（阳性细胞数

2、/总细胞数×100％），再求均值.1.2.4pJNK在肺组织中表达和分布的检测采用二步法免疫组化检测.切片脱蜡至水，30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶5～10min，热修复抗原，血清封闭20min，滴加一抗（1∶100），4℃过夜，二抗为HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃孵育20min，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞.1.2.5pJNK蛋白含量检测采用SF1）提取肺组织总蛋白（每100mg组织加入0.5mL裂解液），BCA比色法定量.取100μg待测蛋白按序加样，SDSPAGE电泳后1

3、00V4℃转移至PVDF膜上，50g/L脱脂牛奶常温下封闭1h，滴加一抗pJNK（1∶1000）4℃孵育过夜，HRP标记的二抗（1∶2500）常温孵育1h，ECL化学发光曝光5min，由ChemiDocXRS图像采集系统（美国BioRad公司）采集图像.结果分析采用QuantityOne4.5.0软件读取各个目的蛋白条带的校正积分光密度值，以GAPDH作为内参照，pJNK蛋白含量用ApJNK/AGAPDH表示.统计学处理：实验数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析，多样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSDt检验，P0.05为差异有统计

4、学意义.2结果2.1肺损伤病理学观察空气对照组及空气＋JNK抑制剂干预组肺组织结构无明显异常.高氧暴露3及7d组肺泡上皮细胞肿胀，肺泡壁增厚，肺间质充血、水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，尤以高氧暴露7d组更明显.高氧暴露14d组肺内炎性渗出减少，水肿减轻，肺间质及成纤维细胞增生明显.高氧暴露7d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7d组肺泡结构紊乱有所改善，肺泡壁增厚及肺间质充血、水肿减轻，炎性细胞浸润减少.2.2肺组织细胞凋亡的变化及分布空气对照组及空气＋JNK抑制剂干预组肺组织中均少见TUNEL阳性细胞，两者凋亡指数比较无显著性差异（P0.05）.而高氧暴露3，7，14

5、d组肺组织中可见大量的TUNEL阳性细胞，其凋亡指数均显著高于空气对照组（P0.05），尤以高氧暴露3，7d明显，高氧暴露14d稍有回落.高氧暴露7d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7d组肺组织TUNEL阳性细胞则明显减少，两者凋亡指数比较有显著性差异（P0.05，表1）.凋亡细胞主要见于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞及血管内皮细胞，部分巨噬细胞及间质细胞也呈凋亡改变.表1各组肺组织细胞凋亡指数及pJNK蛋白含量的相对变化（略）aP0.05vs空气对照；cP0.05vs高氧7d；eP0.05vs高氧14d.2.3pJNK阳性细胞在肺组织中表达和分布的变化空气对照组肺组织

6、偶有少量pJNK阳性细胞表达，高氧暴露各组肺组织阳性细胞则明显增多，以高氧暴露7d组增多最为明显.空气＋JNK抑制剂干预组较空气对照组肺组织阳性细胞稍有减少，高氧暴露7d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7d组肺组织阳性细胞明显减少.阳性细胞广泛分布于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、间质细胞及浸润炎症细胞（图1）.2.4肺组织pJNK蛋白表达含量的变化空气对照组肺组织仅有少量pJNK蛋白表达，高氧暴露3，7，14d组肺组织pJNK蛋白表达含量显著增加.空气＋JNK抑制剂干预组及高氧暴露7d＋JNK抑制剂干预组肺组织pJNK蛋白表达含量较相应未

7、干预组均显著减少（P0.05，图2，表1），表明JNK抑制剂SP600125在空气和高氧下均能特异性阻断JNK的激活.3讨论高氧肺损伤是弥散性肺泡炎和损伤后修复重建的复杂病理生理过程，其肺损伤早期特征性改变是肺泡上皮受损，继之出现成纤维细胞增生，最终导致肺纤维化的发生［5］.目前认为细胞凋亡在高氧肺损伤的发病过程中具有十分重要的作用，可导致肺组织气血屏障受损和间质水肿，并可能由其激活成纤维细胞及损害细胞的修复过程，从而最终导致肺纤维化［6-9］，但其具体机制仍不清楚.A：空气对照组；B：高氧暴露3d组；C：高氧暴露7d组；D：高氧暴露14