jnk信号通路在二甲基胂酸所致人胚肺成纤维细胞dna损伤和凋亡中的作

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1、南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文题邀焦墨鎏整查丕里塞盟堕盟鍪冬墅韭盛堑箜塑整壁照筮塑篓塑烫室史煎笠曼．是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所敛的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专监：一者签名：焯霹期：触础论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。

2、作者签名：多年导师签名：』咀数霹期：龇鬻窳嚣科大学硕士攀彼论文斟K僖号通路在二甲基嚣枣酸所致人胚萎奉成纤维细臆DNA损伤和凋亡中的作用南京医科大学公共卫生学院，南京210029研究生尹仕伟指导教师刘起展教授指导小组周建伟教授李患截教授李爱萍助理研究员中文摘要砷是人类确定(I类)致癌物，通过食用含有无机砷化物的水和食物所季

3、起的砷中毒在全世界广泛存在。另外一方萄，砷还是多种肿瘤有效化学治疗药物，因此，环境和医源性接触砷化物的机会大大增加。二甲基胂酸(DMA)是无机砷在人体肉的主要的甲基化代谢产物，其本身也广泛用作杀虫剂。传统的观念一直认为砷在体内的甲基化过程是一个解毒促排泄过程

4、，但是最近有研究表明D凇可警l起细胞DNA断裂，DNA-蛋白质交联和细胞凋亡，认为DMA具有遗传毒性和致癌性。最近越来越多的研究表碉砷的甲基化过程可能幂仅仅是含解毒机制，砷在体内的甲基化过程可能在砷致癌过程审发挥重要作用。罄前关于砷甲基化代谢产物在体外毒褴机制的研究较少，DMA损．伤细胞的机制还不太清楚，其中关于信号通路在其中的2鬻索医零萼大学硕士攀僚论文作用的研究比较少。c-Jurt氨基朱端激酶(JNK)信号通路是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK》家族信号通路的重要囊通路之一，，其参与调控细胞增殖、分化与凋亡。有研究发现孙派信号通路在无机砷及其他合物鼹致细胞损伤中发挥一定作用。

5、霾诧，阐明DMA所致细胞损伤及英分子机制对于探讨砷致癌分子机制及砷中毒的防治具有重要意义。本课题拟探讨不溺浓度D淞对人胚肺成纤维细胞(HELF)N殖、DNA损伤、细胞周期和凋亡及nⅨ信号通路的影响；并应用扑K抑制荆和反义抑制技术构建扑Ⅸ缺陷HELF．细胞，以阻断心x信号通路来深入探讨羚淤信号通路在DMA所致胍LF细胞DNA损伤和凋亡中的作用，为进一步揭示DMA所致细胞损伤的分子机制，全面了解砷的致癌分子机制和砷化物对机体的影响提供一定的科学依据。方法一、DMA对HELF细胞增殖的影响用0．0、2．5、5．0、10。0、20．0grnol／LDMA分别处理HELF细胞12、24

6、、48h，用MTT法和CCK．8法检测HELF细胞相对增殖率，寻找其所致HELF细胞增殖蜷剂量。效应和时间．效应关系。二、DMA对HELF细胞DNA损伤的影响用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0gmol／LDMA分别处理HELF细胞12、24、48h，收集HELF细胞蛋白，用Westernblot检测HELF细胞v．H2AX蛋白表达水平，并用鼠一张膜上相应泳道的[3-actin条带的灰度进行校正。篱京医秘大学硕士学位论文三、DMA对HELF细胞周期的影响用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0狮aaol／LDMA分别处理I／ELF细胞48h或用20．0tamol几

7、DMA分别处理HELF细胞12、24、48h，收集细胞，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。四、DMA对HELF细胞凋亡的影响周0．0、2．5、5．0、10．0、20．0pmol／LDMA分别处理HELF细胞12、24、48h，分别用Hoechst33258法检测HELF细胞凋亡形态学变化及细胞凋亡率和用Westernblot检测HELF细胞断裂Caspase3蛋白表达水平，寻找其剂量．效应乖时间一效应关系。五、DMA对HELF细胞磷酸化J-NK表达水平的影响用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0}tmol／LDMA分别处理HELF细胞12、24、48h，收集HELF细胞蛋

8、白，用Westernblot检测HELF细胞JNK、和磷酸化JNK蛋白表达水平，并用同一张膜上相应泳道的[3-actin条带的灰度进行校正。六、J-NK缺陷I-IELF细胞株建立从HELF细胞中抽提总RNA，用RT-PCR法扩增霹的DNA片段，经重组技术构建JNK基因反义RNA绿色荧光真核表达质粒，将重组质粒转染I／ELF细胞，经G418筛选后，用Westernblot检测JNK蛋白含量，确认获得JNK缺陷HELF细胞株。七、抑制JNK对DMA所致细胞DNA损伤与凋亡的影响预先用20．0pxnol／LJ