高氧性肺损伤中mapk信号途径的表达及其作用机制论文

《高氧性肺损伤中mapk信号途径的表达及其作用机制论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、高氧性肺损伤中MAPK信号途径的表达及其作用机制论文【摘要】目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路三亚族ERK，p38，JNK在大鼠高氧性肺损伤动物模型中的表达及作用.方法：24只3周龄APK)信号转导途径与多种氧化应激性疾病密切相关［2-3］.我们以幼年APK信号通路中3个主要亚族成员细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK），cJun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK）,p38激酶在不同高氧暴露时间段肺组织的分布以及蛋

2、白表达，并分析MAPK信号转导途径与高氧肺损伤的关系.1材料和方法1.1材料3周龄APK抗体的分布，其余部分置于-70℃冰箱保存，行phosphop44/p42，p38，SAPK/JNKAPK在肺组织中的分布切片脱蜡至水，30mL/LH2O2封闭内源性过氧化物酶5～10min，热修复抗原，血清封闭20min，滴加一抗，分别为磷酸化ERK多克隆抗体（1∶250），磷酸化p38多克隆抗体（1∶1000），磷酸化JNK多克隆抗体（1∶100），4℃过夜.二抗为HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃20min孵育.DAB

3、显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞.1.2.4肺组织胞浆蛋白提取和定量滴加液氮于研钵粉碎组织块，加入改良RIPA缓冲液（TrisHCl50mmol/L，NaCl150mmol/L,EDTA1mmol/L,NaF50mmol/L,Na4P2O72.5mmol/L，Na3VO41mmol/L，TritonX10010mL/L，甘油100mL/L，SDS1g/L，脱氧胆酸钠5g/L，leupetin100umol/L，PMSF1mmol/L.每100mg组织加入0.5mLRIP

4、A裂解液，充分匀浆，冰浴作用30min,4℃12879g离心30min.此操作过程均在冰上进行以防止蛋白降解.取上层液体-20℃保存.用BCA比色法测定蛋白质浓度.1.2.5磷酸化ERK，p38，JNK蛋白含量检测用APK蛋白在肺组织的分布空气对照组偶有少量磷酸化ERK，p38，JNK阳性表达，主要见于肺泡上皮细胞及气道上皮细胞，高氧暴露组则阳性细胞明显增多，广泛分布肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞以及浸润炎症细胞、支气管黏膜下水肿间质的纤维细胞.p38尤其高表达于大量浸润炎性细胞.三种MAPK蛋白表达的细胞类型基本

5、相同(图1).2.3肺组织磷酸化ERK/p38/JNK蛋白含量变化与空气对照组比较，各高氧暴露组ERK/p38/JNK蛋白表达明显增强.phosphoERK，phosphoSAPK/JNK在高氧暴露7d组表达最为明显（P﹤0.05），phosphop38在高氧暴露14d组表达最为明显（P0.05，图2，表1）.表1各组肺组织MAPK蛋白含量相对变化（/GAPDH）（略）3讨论MAPK是一类丝－苏氨酸激酶家族，能介导大量细胞外应激的细胞反应，如炎症细胞因子、热休克、紫外线照射、机械牵张刺激、渗透压应激等［4-6］.MAP

6、K家族最重要的3个亚族中，p38和JNK属于“应激诱导”的MAPK，而ERK被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的MAPK.免疫组化显示ERK，JNK，p38在空气对照组仅少量表达于肺泡上皮细胞及气道黏膜上皮，高氧刺激后上述MAPK家族成员被激活，且肺内多类细胞参与了此种过程，除肺泡上皮、气道上皮外，还包括浸润炎症细胞、胸膜间皮细胞、间质纤维细胞，尤其p38阳性表达显著见于单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等炎性细胞内，这与之前研究发现p38的激活主要见于炎症反应相吻合，进一步提示了p38是MAPK家族参与炎症反应最重要的成员［7

7、-9］.近年发现在许多细胞体系中，活性氧自由基（reactiveoxygenspecies,ROS）能激活MAPK通路而调控细胞的增殖、分化、生存及凋亡［10-11］，但是在不同的细胞，不同的刺激模型，氧化应激激活MAPK的报道不尽相同.Han等［12］从高氧暴露的大鼠肺组织悬液收集培养肺泡Ⅱ型上皮细胞，发现ERK被激活而p38，JNK活性却无明显改变.而用于生成胞内超氧阴离子的吩嗪硫酸甲酯能激活仓鼠肺成纤维细胞（V79）JNK以及p38,却对ERK1/2无活化作用［13］.本研究发现，在高氧暴露3d时，即可检测到有明显的J

8、NK活性增加；在发生急性肺水肿最显著的高氧暴露7d组，ERK及JNK的活性表达最强，而p38最强表达则在有纤维化表现的高氧暴露14d组.Carvalho等［14］给予原代肺泡Ⅱ型上皮细胞H2O2刺激，ERK，JNK，p38亚族均被激活，也发现它们激活的时间显著不一致，说明ROS激活MAPK