老鼠簕对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究

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1、老鼠簕对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究梅燕林军侯软玲刘林【摘要】　　目的研究老鼠簕对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGFβ1）与Smad3mRNA表达的影响。方法）的合成和降解失调。肿瘤坏死因子α（TNF-α）在肝纤维化始动激活及调控中具有重要作用；转化生长因子β1（TGFβ1）是导致肝纤维化的最重要的细胞因子,其作用的发挥和细胞内信号转导蛋白Smad密切相关。其中，Smad3是介导TGFβ1诱导肝纤维化的关键分子。本实验观察老鼠簕治疗大鼠实验性肝纤维化的疗效，研究大鼠肝组织TNF-α、TGFβ1与Smad3m

2、RNA的表达情况，探讨老鼠簕对大鼠肝纤维化的治疗机制。　　1材料　　1.1动物清洁级l-1的药液；取50g老鼠簕乙醇浸膏，用单蒸水配制成低剂量浓度为0.1g·ml-1的药液。-4℃保存备用，使用前摇匀；秋水仙碱（西双版纳股份药业有限责任公司，批号：060717），用单蒸水配制成浓度为0.040mg·ml-1的药液。　　1.3试剂四氯化碳（上海化学试剂公司，批号20050393）。Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）；RT-PCR逆转录试剂盒（美国Fermentas）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号20070126）；三氯甲烷（重庆川江化学试

3、剂厂，批号20070507），异丙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号20070418）。　　2方法　　2.1建立大鼠肝纤维化模型〔2〕及给药方法60只l·kg-1，以后每周2次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.03ml·kg-1。空白对照组仅皮下注射等体积植物油。连续8周。在注射四氯化碳4周后，秋水仙碱组以0.4mg·kg-1、老鼠簕乙醇浸膏高、低剂量组分别以2.0，1.0g·kg-1，用等容量给药法按10ml·kg-1灌胃，1次/d。空白对照组和模型对照组给予等容量的生理盐水。连续4周。　　2.2标本采集所有大鼠于第8周末处死，取肝左叶组织1块，于-70℃保存。　　2

4、.3肝组织TNF-α、TGFβ1与Smad3mRNA的表达测定Trizol提取大鼠肝组织总RNA，方法按试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA纯度，按RT-PCR逆转录试剂盒说明把mRNA逆转录成cDNA。RT-PCR分析TNF-α、TGFβ1与Smad3，β-actin作为内参。TNF-α、TGFβ1、Smad3和β-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TNF-α上游引物序列：5’TGCCTCAGCCTCTTCTCATT3’，下游引物序列：5’TGGTATGAAGTGGCAAATCG3’，扩增产物长度为404bp；TGFβ1上游引物序列：5’

5、TACAGGGCTTTCGCTTCAGT3’，下游引物序列：5’TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC3’，扩增产物长度为394bp；Smad3上游引物序列：5’GCAGTGGCAATCACAGAGAA3’，下游引物序列：5’AACAGCCTGGGAGAGACTCA3’，扩增产物长度为386bp；β-actin上游引物序列：5’AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG3’，下游引物序列：5’TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT3’，扩增产物长度为240bp。取5μg总RNA按逆转录试剂盒说明书逆转成cDNA。以cDNA为模板分别按以下条件PCR反应扩增

6、TNFα、TGFβ1和Smad3片断。TNF-αPCR条件：94℃4min30s，94℃30s，52℃30s，72℃1min，30个循环，72℃8min；TGFβ1PCR条件：94℃4min30s，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃8min；Smad3PCR条件：94℃4min30s，94℃30s，53℃30s，72℃1min，30个循环，72℃8min。取5μlPCR产物，在2%琼脂糖凝胶（含溴乙啶）上电泳，电泳条件：120V，20min，凝胶电泳成像分析系统采集图像。以内参β-actin为基准作半定量分析，以扩增目的基因区带的灰度值与内

7、参β-actin区带的灰度值之比确定各扩增目的基因的相对表达水平。　　2.4统计学方法用SPSS13.0软件分析，计量资料用±s表示，多样本均数采用方差分析。P＜0.05表示差异有显著性意义。　　3结果　　3.1肝组织总RNA的提取提取的总RNA通过测定OD260/OD280比值均介于1.7～2.0之间，表明各样品RNA纯度符合实验要求。经1%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察，未见RNA明显降解。　　3.2肝组织TNF-α、TGFβ1与Smad3mRNA的表达大鼠肝组织TNF-αmRNA、TGFβ1mRNA、Smad3mRNA均表达，见图1～3。从表1可知