分子生物学实验实验操作

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1、重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建分子生物学实验-实验操作基因、载体、受体菌株基因载体菌株质粒酶切连接转化质粒提取PCR实验技术要求应掌握的实验技术酶切,连接凝胶回收制备感受态细胞质粒提取PCR琼脂糖凝胶电泳考察指标电泳电泳感受态细胞转化率电泳电泳电泳实验流程:第一天rhIL-18基因的PCR产物质粒pUC18BglⅡ和PstⅠ双酶切BamHⅠ和PstⅠ双酶切浓度1%琼脂糖凝胶电泳凝胶回收配制LB液体与固体平板培养基灭菌实验流程:第二天凝胶回收与溶液回收电泳检验T4连接酶连接过夜E.coliDH5α菌株37℃过夜培养实验流程:第三天提取质粒DN

2、A浓度1%琼脂糖凝胶电泳实验流程:第四天PCR浓度1%琼脂糖凝胶电泳双酶切反应（20μL体系）rhIL-18的PCR产物PCR产物10μLBufferO2μL无菌水7μLBglⅡ0.5μLPstⅠ0.5μL质粒pUC18质粒10μLBamHⅠBuffer2μL无菌水6.7μLBamHⅠ0.3μLPstⅠ1μL37℃酶切反应3小时。Hybridsite培养基配制LB液体培养基每1L配量：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠5g调节pH到7.0LB固体培养基:每100ml液体培养基添加1.5g琼脂每组准备：1个30ml液体培养基灭菌1个30mlLB液体培养基微量移液器枪

3、头（200uL）琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA分子的构象电源电压嵌入染料的存在离子强度影响琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒分别对：目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。2.按300μL/100mg（3:1）的比例加入BindingBufferⅡ，置于50-60℃水浴中10min，使凝胶彻底融化。

4、期间，每2min混匀一次。3.将融化的溶胶液转移到套在2-ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2min。12000rpm室温离心1min。4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μLWashSolution，12000rpm室温离心1min。5.重复步骤4一次。琼脂糖凝胶回收6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心2min。7.将UNIQ-10柱放入一根新的Ep管中，在柱子膜中央加30μLElutionBuffer，60℃放置5min。8

5、.12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。从溶液中回收DNA：根据溶液的体积，加入3倍体积的BindingBufferⅡ混匀。以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8.计算基因与载体片段比例紫外下观察基因与载体片段的亮度基因的摩尔数≈基因片段亮度/碱基数（495bp）载体的摩尔数≈载体片段亮度/碱基数（2700bp）基因摩尔数/载体摩尔数最佳比例是3：1连接反应⑴在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行⑵20μL体积反应体系中：10×快速连接缓冲液2μLrhIL-18双酶切产物XμL质粒pUC18双酶切产物YμLT4-DNA

6、连接酶1μL20℃1h，4℃过夜感受态菌的制备（1）E.coliDH5α菌株37℃过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.3mL加入到30mLLB培养基中，37℃，230r/min振荡培养3h，至OD600约为0.4左右。（2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。（3）在预冷4℃的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入30mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1mo

7、l/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，200μL/管分装。pUC18-hIL-18重组质粒的转化（1）向分装有200μLE.coliDH5α菌株感受态细胞的EP管中加入10μL的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30min。（2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。（3）向EP管加入800μLLB培养基，转移至37℃摇床上，150r/min，温育45min以复苏菌株。（4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。（

8、5）将平板置于室温下至液