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时间:2018-02-27
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1、分子生物学实用技术(S219)实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员实验一CTAB法提取植物基因组总DNA及分析一、实验目的分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求,CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法,可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料(如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等)中的DNA,得率高,质量好,用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。二、基本原理植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁,游离出细胞器和原生质,并防止DNA降解。
2、采用CTAB(十六烷基三甲基溴化胺,一种非离子型去污剂)抽提液抽提(65℃)上述研磨物,在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质,而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物,采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质(沉淀相)去除,水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀,CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中,吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的D
3、NA则应进一步纯化。用RNase水解RNA,用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等,经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。三、实验材料甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)幼叶。四、主要仪器设备及耗材Eppendorf5804R低温离心机,HettichUniversal32R低温离心机,EppendorfMinispin离心机,SanyoSIM-F124制冰机,TOMYSS-325自动灭菌锅,MilliporeElix纯水系统,Eppendorfresearch微量移液器系列,GingT
4、ianJA2003A电子天平,SatoriusPB-10pH计,HH·S21-4-S恒温水浴锅,UVPGDS8000自动高效紫外透视成像仪,DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽,GenespecI快速核酸蛋白自动分析仪,长岭BCD-239家用冰箱,TNZ-30-50液氮生物容器及液氮,微波炉,研钵,离心管(15ml、1.5ml),枪头(10、200和1000μl),两面板,枪头盒,离心管盒(1.5ml)等。五、主要试剂1、CTAB抽提液:2%(w/v)CTAB100mmol/LTris-HCl(pH=8.0
5、)20mmol/LEDTA(pH=8.0)1.4mol/LNaCl最后pH值8.0。抽提含多酚较多的植物材料时,上述抽提液中可另加入2%的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。抽提液于室温保存,可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入终浓度为2%-3%(v/v)的β-巯基乙醇。2、醋酸钠溶液:3mol/LNaAc,用冰乙酸调pH值至5.2。3、TE溶液:100mmol/LTris-HCl1.00mmol/LEDTA最后pH值8.0。4、其它:无水乙醇,异丙醇,75%乙醇,酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),
6、氯仿/异戊醇(24:1),β-巯基乙醇,重蒸水,单蒸水,RNaseA(10μg/μl),琼脂糖,6×上样缓冲液,λHindIIIDNAmarker,EB溶液(0.25μg/ml),1×TAE缓冲液。六、实验步骤(一)、DNA的粗提A)向15ml离心管中预先加入5mlCTAB抽提液及0.1ml的β-巯基乙醇,混匀,65℃预热;B)1.00g幼叶用液氮磨成粉末,迅速用药勺转入该15ml离心管中,盖严后迅速摇匀;12分子生物学实用技术(S219)实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员A)于65℃水浴45m
7、in,中途间隔轻柔颠倒混匀3-4次;B)冷却后加入等体积(5ml)氯仿/异戊醇,轻柔颠倒混匀使乳化10min;C)10000rpm室温离心10min;D)吸取上清于另一干净的15ml离心管中;E)加入与上清液等体积(约5ml)的异丙醇,颠倒混匀,约1至2分钟后应有白色絮状沉淀出现;F)(若没有,则加入上清液1/5至1/10体积即0.5-1.0ml的醋酸钠溶液,混匀至形成沉淀团);G)用尖头剪大的1.5ml枪头吸住沉淀团,移入盛有1ml75%乙醇的1.5ml离心管中。若无法直接吸取,则于4℃、1000rpm离心3
8、min收集沉淀DNA;H)在75%乙醇中漂洗沉淀DNA数分钟以上,用枪头吸干乙醇;I)用0.5ml75%乙醇再漂洗2次;J)无水乙醇漂洗1次;K)沉淀于室温或37℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明,不要过度干燥;L)用500μlTE溶解沉淀,可用65℃水浴助溶,DNA粗提物可用于粗略PCR等。(二)、DNA的纯化A)向TE溶解的DNA粗提物中加入4-10μlRNaseA(约40-1
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