分子生物学实验常规技术操作

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1、实用文档分子生物学实验常规技术操作目录1.质粒提取1.1小提质粒1.2小量快提质粒鉴定：1.3大提质粒：2.酶切2.1制备型酶切2.2小量酶切鉴定2.3DNA片段5'突出端的补平3.琼脂糖凝胶电泳4.回收4.1从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段4.2小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）4.3无水乙醇沉淀回收5.连接5.1一般连接5.2平端动态连接6.转化6.1质粒快速转化6.2连接物转化7.制普通固体培养板8.涂板9.挑菌10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)哺乳动物细胞单克隆株分离常用溶液、培养基配制实用文档1.质粒提取：1.1小提质粒：本实验室在常规条件下

2、采用碱裂解法小量提取质粒(1)从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(5～50uL)，接种于3mLLB液体培养基中（加有相应的抗生素），37℃振荡培养至OD2.0以上，但也无需过浓。*通常DH5а菌株摇12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr*(2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000rpm离心15～30sec，弃上清。通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。*不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理*(3)加入150uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分悬浮。*务必悬浮完全*(4)加入150u

3、L溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。*可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘*(5)加入180uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈。*可观察到白色团片状沉淀出现。*(6)置冰浴10分钟，也可置于-20℃中5min。(7)12000rpm离心8～10分钟。(8)在离心过程中可取未灭菌的新1.5mLEppendorf管，加入等体积(350～400uL即可)酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）备用；取灭菌过的新1.5mLEppendorf管，加入2倍体积(780uL即可)的无水乙醇置于-20℃备用。*加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层

4、的Tris-cl保护液*(9)离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-异戊醇中,充分混匀。*小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中*(10)12000rpm离心4～5分钟。(11)吸水相，加入已加好的无水乙醇中,颠倒混匀几次。*小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相*(12)-20℃放置5～15分钟。(13)12000rpm离心10分钟。(14)迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干。*小心不要将沉淀洗掉*(15)置于恒温器上干燥(55℃)至无色透明或无乙醇气味，一般大约5～10min。(16)加入30～40uL1×TE缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用

5、。*做完实验请及时收拾实验台*1.2小量快提质粒鉴定：（目前较少采用）(1)取培养的菌液1mL，12000rpm离心30s，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。(2)用50uL无菌水充分悬浮菌体。实用文档(3)每管加入50uL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）并充分混匀。(4)12000rpm离心10分钟。(5)小心吸取5uL上清上样电泳。(对于插入片段足够大的重组子，其迁移率应低于未插入片段的对照质粒。)*做完实验请及时收拾实验台*1.3大提质粒：(1)从－20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液，接种到3～4mL的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为1.6～1.8。(2

6、)取0.5mL菌液接种到200mLLB培养基中，37℃振荡培养至OD600为2.0以上，再加入氯霉素至170ug/mL，37℃继续振荡培养12～16hr。(3)将摇好的菌液4000rpm离心15min。(4)弃上清，敞开离心管口倒置，尽量让上清全部流尽。(5)用预冷的40mLSTE充分悬浮菌体沉淀。(6)4℃，4000rpm离心10min。(7)弃上清，敞开离心管口倒置，让上清全部流尽。(8)用预冷的4mL溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。(9)加入新鲜配制的溶液Ⅱ8mL，上下颠倒几次，液体会变得澄清，置于4℃10min。(10)加入预冷的溶液Ⅲ6mL，上下颠倒混匀后，4℃中放置

7、30min。(11)4℃，12000rpm离心10min。(12)收集上清，加等体积的异丙醇，4℃放置30min。(13)4℃，10000rpm离心10min。(14)弃上清，用70％的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1mL1×TE中。(15)加50uLRNaseA，37℃作用2小时。(16)加1mL新配制的13％的PEG8000溶液（13%PEG8000，1.6MNaCl），充分混匀，4℃放置30min。(17)4℃，12000rpm离心15min。(18)吸去上清，用400uL1×TE溶解沉淀。(19)加1/4体积4MLiCl，室温放置