分子生物学常规实验方法

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1、实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competentcells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培

2、养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0mol/LNaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，800mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏

3、水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，800mL蒸馏水溶解后，用1.0mol/LNaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1000mL，然后加入琼脂粉15g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1g，用双蒸水溶解，并定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素

4、钠0.5g，用蒸馏水溶解并定容至5mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。3.实验材料E.coliDH5α,pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2mLLB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。2.将2mL过夜培养物转接到盛有100mL的LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2h）。3．取1mL培养物于一灭菌的Eppendorf管中，冰浴放置10～30min，4℃，1500×g离心5min，弃上清。4．沉淀用0.2mL冰冷氯化钙溶

5、液轻轻悬浮，冰浴放置15min，4℃，1500×g离心5min，弃上清。5．沉淀再用0.2mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。6.取5µLpUC18质粒(不超过10ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。7.42℃热激90s后，迅速置于冰浴5min。8.加入800µL培养基，37℃振荡（100r/min）温育1h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。9.取200µL涂布于含氨苄青霉素钠(100µg/mL)的LB固体培养基上,正向放入37℃培养箱中培养1h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落

6、数量。【注意事项】1．应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。2．整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。3．每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。【实验作业】根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率（cfu/µgDNA）。参考文献1．卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.287~2892．刘进元等.分子生物学实验指导.北京：清华大学出版社，2002.22~253．CohenSN,ChangACY,HsuL.Nonchromosomalantibioticresistance

7、inbacteria:GenetictransformationofEscherichiacolibyR-factorDNA.ProcNatlAcadSciUSA,1972,69:21104.魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999.53～55实验二质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。【实验原理】在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA

8、与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷，电泳时向正极移动，不同DNA的电泳迁