分子生物学实验方法(1)

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1、分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系9实验1植物总DNA的提取和紫外分析一、实验目的了解植物DNA提取的主要方法及其原理，掌握SDS法或CTAB法抽提植物总DNA的基本程序和操作要求。二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子。一般地说，总DNA主要是指基因组DNA（genomicDNA），

2、即细胞核内的染色体DNA分子。植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和CTAB法。CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mMNaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用

3、70％～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高。三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等）2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4MNaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）、氯仿/异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲

4、液。四、实验方法与步骤（一）CTAB法提取植物叶片DNA1、植物组织的破碎：取0.1g新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。2、细胞的破碎：迅速加入1ml预热（65℃）的CTAB提取缓冲液，65℃水浴中保温30min以上，每5min上下颠倒1次。93、核酸的分离：12000g离心5min，吸取上清液约600µl，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。重复操作2次。4、12000g离心5min，取上清于一新1.5ml离心管，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇溶液，

5、混匀，-20℃放置10-30min。5、12000g离心10min，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。6、核酸的溶解：加入20µlTE缓冲液或无菌水，混匀即可。（二）DNA的定量分析核酸的纯度和浓度可以用紫外分光光度计测定，OD值代表光密度，下标数字表示光波长，DNA样品OD260/OD280值为1.8，RNA样品OD260/OD280值为2.0，表明样品纯度较好。若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染。OD260的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA或40μg/

6、ml单链RNA。1、取DNA原液5µl稀释至3.0ml，用紫外分光光度计测定230nm、260nm及280nm的吸光值。2、DNA浓度（mg/mL）=50×（260nm的读数）×稀释倍数分光光度法是测定物质浓度的常用方法，DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强的吸收能力，因而在260nm处具有一个强烈的吸收峰；蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在280nm波段有一强烈的吸收峰，利用上述特点可以测定物质含量。教材的公式中“50”的含义是：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260（OD是光密度opticaldelns

7、ity的缩写）为1相当于50mg/mL的dsDNA（双链DNA），40mg/mL的RNA，37mg/mL的ssDNA（单链DNA）以及30mg/mL的寡核苷酸，因此若是测定RNA的含量，50应该换为40，其他物质以此类推。3、DNA纯度：1.7

8、A的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。但RNA很容易被内源及外源的RNase降解，所以要得到未被降解的、不含DNA与其它杂质的RNA是进行分子生物学研究的前提。目前较为成熟的分离RNA的方法有许多，用于植物细胞总RNA的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、SDS/酚抽提法，或应用商品化的Trizol试剂和Qiagen等各类