rnai的实验原理和操作实用技术

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1、RNAi的实验原理和操作实用技术几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。   此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。RNAi肯定有很多新用途，RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。RNAi实验原理与方法   近年来的研究表明，将与mRN

2、A对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。  一、RNAi的分子机制   通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinter

3、feringRNAs,siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。   在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的

4、将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。   另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.   二、如何进行RNAi试验  (一)siRNA的设计   1.在设计RNAi实验时，可以先

5、在以下网站进行目标序列的筛选：http://www.genesil.com/business/products/order2.htmhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710   2.RNAi目标序列的选取原则：   (1)从转

6、录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。   Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。   (2)将潜在的序

7、列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）   (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。   3.阴性对照   一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以

8、保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。   4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.htmlhttp://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlhttp://python.penguindreams.net/Order_