RNAI实验步骤案例

《RNAI实验步骤案例》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、RNAI实验步骤案例1、RNAI技术简介RNAi(RNAinterference，即RNA干涉)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的[1]。RNAi现象首先是1998年在线虫中发现。Fire及其同事们在尝试着用反义RNA抑制基因表达时，试图研究正链RNA与反义RNA的协同作用，然而他们却意外地发现正链RNA与反义RNA的混合物，即双链RNA对基因的沉默作用较任一单链RNA都要强十倍以上[1]。这种双链RNA

2、导致的RNA干涉现象随后在果蝇、昆虫、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞中也分别发现，并且在线虫中，RNA干涉对90%以上的基因的转录后表达产生抑制作用[2]。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。RNAi机制包含两个过程：首先dsRNA被Dicer切割产生siRNA；然后RISC识别并结合siRNA。介导靶基因mRNA在与dsRNA同源的区段内，按照同样的间隔被降解成21～23nt的小片段[3]。1.1microRNA简介microRNA（简称miRNA

3、）是一类由基因组编码、细胞内源表达的、约为22nt的非编码小RNA。它通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译过程（高等动物中主要是后者），来调控真核细胞的基因表达[3]。虽然microRNA可以引发靶基因mRNA的降解，或转录抑制，但多数情况下（尤其是在高等动物中）主要通过与mRNA的3’UTR不完全的配对抑制其翻译，从而影响很多蛋白质的产量[3]。1.1.1miRNA与肿瘤的研究关于癌症基因研究的的最新进展是miRNA领域，miRNA是长度大约在22个核苷酸的单链RNA分子，miRNA可以通过调节靶mRNA的平移效率来负性调节基因的表达。miRNA参与了许多细胞过程，包括细胞增殖，分化，

4、发育，细胞凋亡，炎症反应，应激反应，能力代谢，衰老，细胞迁移等[3]。miRNA也可能作为癌基因或抑癌基因，并已在多种肿瘤发现miRNA的异常表达，其中就包括乳腺癌，肺癌，前列腺癌和结肠癌等。癌症相关的miRNA研究中指出，let-7家族是可以负性调控癌基因Ras基因表达的一种miRNA。Let-7是目前研究最多的miRNA，有多项研究指出在人类肿瘤中各种let-7基因定位在肿瘤基因中的缺失区域[4]。C-kit基因是一种编码酪氨酸激酶生长因子的受体蛋白，与大部分恶性肿瘤的发生、增殖、迁移相关。miR-211和miR-222与原癌基因C-kit的蛋白表达量呈负相关。此外，还发现miR-

5、211和miR-222还可以通过抑制抑癌基因P27基因的表达从而促进细胞增殖[4]。2.实验仪器、材料、试剂2.1细胞系小鼠黑色素瘤细胞系（B16）2.2主要生化材料、试剂盒①细胞培养基：DMEMhighglucose，RPMI-1640②胎牛血清③0.25﹪胰酶④二甲基亚砜（DMSO）⑤其余试剂如：无水乙醇、甲醇、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸盐缓冲液（PBS）等均为国产分析纯。2.3主要仪器设备①高压灭菌锅②微量移液器③电子天平④细胞计数板⑤高速台式冷冻离心机⑥二氧化碳细胞培养箱⑦倒置显微镜⑧VORTEX涡旋震荡器、高速冷冻离心机、台式离心机、-80℃低温冰箱、普通冰箱

6、、超净工作台、紫外分光光度计等2.4主要耗材①细胞培养板：6孔培养板、96孔培养板②细胞培养皿：35mmDish，60mmDish，100mmDish③离心管：1.5ml，15ml3.实验方法3.1miRNAmimics和miRNAinhibitor获得miR-26b-5p的miRNAmimics和miRNAinhibitor均可由生物公司设计合成。3.2miR-26b-5p引物设计miR-26b-5p其成熟体序列为：UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU3.2.1反转录之后扩增所需引物设计反向引物（反转录后PCR所需的引物）：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环

7、，固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是miR-26b-5p从后面数八个碱基的反向互补序列，即GAUAGGUU的反向互补：AACCTATC，最后得到的反向引物的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCTATC-3，[5]3.2.2定量引物设计正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列