分子生物学大实验操作指南.doc

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1、分子生物学大实验操作指南单林娜王莲哲编常用试剂的配制方法（一）配方1、1MTris-HCl,pH8.0,500ml60.55gTris+400mlH2O+约26ml浓HCl2、0.5MNa2EDTA，pH8.0,200ml（EDTA难溶于水，应优先配制，并加入适量NaOH助溶）37.22gEDTA+180mlH2O+约8gNaOH片（若是EDTA二钠盐可减半）3、10%葡萄糖10g葡萄糖+90mlH2O4、1MNaOH：4gNaOH+96mlH2O5、KAc(3MK.5MAc)（9.814×3）gKAc+30mlH2O+11.5ml[60.5×2/1.049]

2、冰醋酸+28.5mlH2O——定容至100ml（溶液III:KAc14.7g,HAC5.8mL,加水至50mL。乙酸；醋酸；冰醋酸【英文名称】aceticacid【结构或分子式】CH3COOH【相对分子量或原子量】60.05【密度】1.049醋酸钾(医药级)C2H3KO2F.W.98.14）6、70%乙醇7、TE50ml：10mmol/LTris-HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.01MTris-HCl（pH8.0）0.5ml0.5MNa2EDTA（pH8.0）0.1mlH2O49.4ml8、CTAB抽提液100ml：2%CTAB（十六烷基三

3、乙基溴化铵）100mmol/LTris-HCl,pH8.0/1MTris-HCl（pH8.0）10ml20mmol/LEDTA，pH8.0/0.5MNa2EDTA（pH8.0）4ml1.4mol/LNaCl(8.18g)（二）操作步骤1、刷洗试剂瓶等玻璃器皿清水——去污粉——清水4遍——蒸馏水2遍2、按配方配制试剂计算用量写出配方——称量（学习掌握电子天平用法）——混溶3、灭菌（复习巩固压力锅用法）实验一总DNA提取（4学时）（一）总DNA提取1．目的：学会提取纯化DNA的试剂的配法，学会使用离心机、移液器，掌握总DNA的提取和纯化技术。2．实验原理：在SDS

4、或CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。3．实验器材和试剂试材：刺蛾蛹仪器、用具：离心机、离心管、微量移液器、吸头、吸水纸、

5、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩等。4．实验准备：需配置的药品和缓冲液：提取DNA缓冲液（CTAB法）:2%CTAB(W/V),100mmol/LTris-HCIpH8.0,20mmol/LEDTApH8.0,1.4mol·L-1NaCl，2%PVP(灭菌后加入2%PVP，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）ß-巯基乙醇。TE(pH8.0):称取1.211gTris、0.372gEDTA-Na2，先用800mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH8.0，再用蒸馏水定容至1000mL。高压灭菌20min。氯仿/异戊

6、醇（24:1,v/v）:将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。5．操作步骤：（1）将单头蛹放入1.5ml离心管中，加入足量液氮充分研磨；（2）吸取500μl65℃预热的2×CATB缓冲液[0.1MTris-HCl(PH8)，1.4MNaCl，0.02MEDTA，2%CTAB,0.2%α-巯基乙醇]，注入管中少许，继续研磨后，将余液全部注入；（3）匀浆物置于65℃孵育45~60min，中途混匀数次；（4）短暂离心，将上清液转至一

7、只新管，沉淀用200μl2×CATB再悬浮，孵育20~30min后离心；（5）将两次的上清液合并，用等体积的苯酚/氯仿（1/1）抽提，12000rpm离心10min;（6）水相用等体积的氯仿再抽提一次，12000rpm离心10min;（7）水相与2/3体积异丙醇混合，4℃放置1小时至过夜；（8）10000rpm离心15min使DNA沉淀；（9）用70%乙醇漂洗，干燥，加0.1×TE40μl再悬浮。（10）－20℃保存。（二）总DNA提取产物电泳鉴定1．目的：学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理：DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到

8、凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率