分子生物学常用实验指南

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1、生命科学系2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）132011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备3实验二质粒DNA的转化4实验三质粒DNA的提取5实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA7实验五PCR基因扩增9实验六DNA重组10实验七蓝白斑筛选实验11实验八DNA酶切技术1313实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体

2、。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.紫外分光光度仪四、材料与试剂：1.大肠杆菌top10菌株2.0.1mol/LCaCl2溶液500mL、0.2mol/LCaCl2溶液50mL3..LB液体及固体培养基4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤：1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mLLB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600应在0.4～0.5之间)3.将菌液置冰浴中10min。（同时将

3、0.1mol/LCaCl2溶液、50%甘油预冷）4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。5.用冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/LCaCl2溶液、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。13实验二质粒DNA的转化一、实验目的：掌握质粒DNA的转化技术二、实验原理:DNA能够黏附于感受态细胞的

4、表面，经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Ampr）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。三、仪器：1.超净工作台2.恒温摇床3.恒温水浴四、1.材料与试剂：LB培养基（液体、固体平板）2.感受态3.无菌水五、实验操作步骤：1.200µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。同时做一对照试验：200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全一样。2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。3.冰浴2min。4.复苏：管

5、中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）5.涂平板：取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。待大约30min，让菌液被培养基吸收。6.菌落培养：倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。照相。13实验三质粒DNA的提取一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法二、实验原理  碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧

6、密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。三、仪器、材料与试剂  (一)仪器  1．恒温培养箱  2．恒温摇床  3．小型高速离心机  4．漩涡混合器  (二)材料与试剂 材料：带有pGEM-T质粒的大肠杆菌 试剂：1. SolutionI[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HC

7、l（PH8.0）,10mmol/LEDTA(PH8.0)]2..  SolutionII（0.4mol/LNaOH+2%SDS用前等体积汇合）3.  SolutionIII(5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5mL,DH2O28.5mL)4.  TE缓冲液(PH8.0)[10mmol/LTris.HCl(PH8.0),1mmol/LEDTA(PH8.0)]5.0.5mo1／L(EDTA)6.氯仿：异戊醇（24：1）7.Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）8. RTE(含20µg/mLRNA酶A