消痛贴膏微生物限度检查方法的建立

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1、消痛贴膏微生物限度检查方法的建立李智勤路东旭李金龙【摘要】　　目的建立消痛贴膏微生物限度检查方法。方法参照《中国药典》2005年版微生物限度检查方法，采用常规法和培养基稀释法进行该药品的微生物方法学验证。结果采用常规法时，白色念珠菌、黑曲霉的菌回收率均高于70%，采用培养基稀释法（0.2ml/皿）时，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的菌回收率均高于70%；细菌计数可用培养基稀释法（0.2ml/皿），霉菌和酵母菌计数可用常规法，控制菌铜绿假单胞菌可用常规法检查，金黄色葡萄球菌可用200ml培养基稀释法检查。结论该法能有效地消除药品中抑菌物质

2、的干扰，检出率高。【关键词】微生物限度检查法；方法学验证；消痛贴膏；回收率　　消痛贴膏是藏药外用贴膏剂，其功能主治为活血化淤、消肿止痛，用于治疗急慢性扭挫伤、跌打淤痛、骨质增生、风湿及类风湿疼痛、落枕、肩周炎等。其主要成分为姜黄、花椒、水柏枝、独一味、棘豆等，其辅助药物润湿剂的主要成分为冰片、樟脑、乙醇等。按照《中国药典》2005年版要求〔1〕，笔者进行了消痛贴膏微生物限度检查方法的验证实验。由于该药品的剂型独特，用药时将润湿剂加至药芯上，二者结合体直接接触患者皮肤，并起到药效作用，所以在实验中以润湿剂加至药芯后的结合体作为验证对象。实验中发

3、现，由于此药物处方中有姜黄、花椒、冰片、樟脑、乙醇等，均含有抑菌性，对于某些细菌的生长繁殖有一定的抑制作用，所以采用常规法、培养基稀释法，以消除抑菌成分的干扰，并探讨该法检出药品中污染存活的细菌数量的有效性。　　1器材　　1.1菌种枯草杆菌〔CMCC（B）63501〕、大肠埃希菌〔CMCC（B）44102〕、金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕、黑曲霉〔CMCC(F)98003〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕。　　1.2培养基试剂胆盐乳糖培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；玫瑰红钠

4、琼脂培养基；蛋白胨；真菌琼脂培养基；（中国药品生物制品检定所）。　　1.3试药消痛贴膏（奇正藏药集团，批号分别为：051073、051074、051178。）　　1.4仪器隔水式电热恒温培养箱(型号:PYX-DHS,上海跃进医疗器械厂生产)；霉菌培养箱(型号:MJX-190-Ⅱ,广东省医疗器械厂生产)；电热恒温干燥箱(型号:DHG-9077,上海精宏实验设备有限公司生产)；全自动高压蒸气灭菌锅(型号:LDZX-40SBI,上海申安医疗器械厂生产)；净化工作台(型号:Sl。接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁培养基斜面，培养5～7d，加入5ml0.

5、9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸取孢子菌悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-4（含孢子数为50～100cfu/ml）。　　2.2供试品的处理取2贴，揭除瓦楞膜，将润湿剂加至药芯表面后剪碎（相当于10g），加至pH7.0的100ml氯化钠-蛋白胨缓冲液中，45℃水浴15min，作为1∶10备用液。　　2.3菌回收率测定　　2.3.1试验组供试液1ml与50～100cfu验证用菌株加入平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。　　2.3.2菌液组测定所加验证菌株的菌数，即50～100cfu验证用菌株加入平皿中，培养基注皿，培养

6、、计数。　　2.3.3供试液对照组分别取与试验组中等量的供试液注皿，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。　　菌回收率（%）=（试验组平均菌落数-供试液对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%　　2.4细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证〔1〕　　2.4.1常规法取“2.2”项中制备的供试液1ml加15～20ml菌落计数用琼脂培养基注皿，混匀凝固后，倒置，细菌置30～35℃培养24～48h，霉菌置23～28℃培养48～72h；计数,测定菌回收率。　　2.4.2培养基稀释法取“2.2”项中制备的供试液1ml，按0.2ml/皿加样,再加15～2

7、0ml菌落计数用琼脂培养基注皿，相应温度培养计数，测定菌回收率。　　2.5控制菌检查方法验证　　2.5.1常规法分别取“2.2”项中制备的供试液各10ml，10～100cfu铜绿假单胞菌和10～100cfu金黄色葡萄球菌分别加至100ml胆盐乳糖和100ml营养肉汤增菌液中，按《中国药典》2005年版微生物限度检查方法中控制菌检验方法进行菌回收实验〔1〕。　　2.5.2培养基稀释法取“2.2”项中制备的供试液10ml，10～100cfu金黄色葡萄球菌加至200ml营养肉汤增菌液中，按《中国药典》2005年版微生物限度检查方法中控制菌检验方法进

8、行菌回收实验〔1〕。　　3结果　　验证结果见表1～3。　　表1常规法验证（略）　　表1结果表明：人工污染5株代表菌株，供试液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑菌性