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1、XX大学毕业论文消痛贴膏微生物限度检查方法的建立2014年6月25日消痛贴膏微生物限度检查方法的建立作者：李智勤路东旭李金龙【摘要】目的建立消痛贴膏微生物限度检查方法。方法参照《中国药典》2005年版微生物限度检查方法，采用常规法和培养基稀释法进行该药詁的微牛物方法学验证。结果采用常规法时，口色念珠菌、黑曲霉的菌冋收率均高于70%,采用培养基稀释法(0.2ml/fm.)时，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的菌回收率均高于70%；细菌计数可用培养基稀释法(0.2ml/1111),霉菌和酵母菌计数口J用常规法，
2、控制菌铜绿假单胞菌口J用常规法检查，金黄色葡萄球菌可用200ml培养基稀释法检查。结论该法能有效地消除药品屮抑菌物质的干扰，检出率高。【关键词】微生物限度检查法；方法学验证；消痛贴膏；回收率消痛贴膏是藏药外用贴膏剂，其功能主治为活血化淤、消肿止痛，用于治疗急慢性扭挫伤、跌打淤痛、骨质增生、风湿及类风湿疼痛、落枕、肩周炎等。其主耍成分为姜黄、花椒、水柏枝、独一味、棘豆等，其辅助药物润湿剂的主要成分为冰片、樟脑、乙醇等。按照《中国约典》2005年版耍求［1］,笔者进行了消痛贴膏微生物限度检查方法的验证实验。由于该药
3、品的剂型独特，用药时将润湿剂加至药芯上，二者结合体直接接触患者皮肤，并起到药效作用，所以在实验中以润湿剂加至药芯后的结合体作为验证对彖。实验中发现，由于此•药物处方屮冇姜黄、花椒、冰片、樟脑、乙醇等，均含冇抑菌性，对于某些细菌的生长繁殖有一定的抑制作用，所以采用常规法、培养基稀释法，以消除抑菌成分的干扰,并探讨该法检出药品中污染存活的细菌数量的冇效性。1器材1.1菌种枯草杆菌［CMCC(B)63501］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］＞铜绿假单胞菌［CMCC（
4、B）10104］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］。1.2培养基试剂胆盐乳糖培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；玫瑰红钠琼脂培养基；蛋白陈；真菌琼脂培养基；（屮国药品生物制品检定所）。1.3试药消痛贴膏（奇正藏药集团，批号分别为：051073^051074.051178c）1.4仪器隔水式电热恒温培养箱（型号:PYX-DHS,上海跃进医疗器械厂生产）;霉菌培养箱（型号:MJX-190-II,广东省医疗器械厂生产）；电热恒温干燥箱（型号:DHG-9077,上海精•宏实
5、验设备有限公司生产）；全口动高压蒸气灭菌锅（型号:LDZX-40SBI,上海申安医疗器械厂生产）；净化工作台（型号:SW-CJ-2F,苏州净化设备有限公司生产）。2方法2.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基屮，30〜35°C培养18〜24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物于改良马丁培养基中，23〜28°C培养24〜48h,上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至50〜lOOcfu/mlo接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁培养基斜面，培养5〜7d,加入5ml0.
6、9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌砲了，吸取砲子菌悬液1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-4（含砲子数为50〜100cfu/ml）o2.2供试品的处理取2贴，揭除瓦楞膜，将润湿剂加至药芯表而后剪碎（相当于1（）g）,加至pH7.0的100ml氯化钠■蛋白腺缓冲液中，45°C水浴15min,作为1：10备用液。2.3菌冋收率测定2.3.1试验组供试液1ml与50〜100cfu验证用菌株加入平皿中，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。2.3.2菌液组测定所加验证菌株的菌数，即50〜100cfu验证用菌株加入平血
7、屮，培养基注血，培养、计数。2.3.3供试液对照组分别取与试验组中等量的供试液注皿，立即倾注相应的琼脂培养基，培养、计数。菌回收率（％）=（试验组平均菌落数■供试液对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数X100%2.4细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证［1］2.4.1常规法取“2.2”项中制备的供试液1ml加15〜20ml菌落计数用琼脂培养基注皿，混匀凝固后，倒置，细菌置30〜35°C培养24〜48h,霉菌置23〜28°C培养48〜72h；计数，测定菌回收率。2.4.2培养基稀释法取“2.2”项中制备的供试液1ml
8、,按0.2讪/皿•加样,再加15—20ml菌落计数用琼脂培养基注皿，相应温度培养计数，测定菌回收率。2.5控制菌检查方法验证2.5.1常规法分别取“22,项中制备的供试液各10ml,10〜100cfu铜绿假单胞菌和10~100cfu金黄色葡萄球菌分别加至100ml胆盐乳糖和100ml营养肉汤增菌液中，按《中国跖典》2005年版微生物限度检查方法中控制菌检验方法进行菌回收实验［1］。2.
