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1、单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究朱琴徐炳森黄学锋周颖【摘要】目的建立单细胞的多重巢式荧光PCR技术，为开展常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供依据。方法用四重荧光巢式PCR和毛细管电泳对单个淋巴细胞的KG8、SM6、C6、CethodUsequadruplexnestedfluorescentPCRandcapillaryelectrophoresistoanalysisthepolymorphismtypeofKG8,SM6,C6,C6、C荧光标记。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
2、，具体内外引物序列见表1。第一轮PCR：64个淋巴细胞均应用四重巢式PCR，同时扩增微卫星KG8、SM6、C6和C的dNTP0.5μl，5mM镁离子1.4μl，10μM的KG8正反引物各0.4μl，模板1μl，HighFidelityTaq酶0.07μl，最后用水补充至10μl；PCR循环条件96℃4min,96℃45s,58℃45s，72℃30s，共36个循环,最后72℃再延伸10min。SM6、C6扩增成功率为89.06%（57/64），CW4扩增成功率为92.18%(59/64)，CW2扩增成功率为89.06%（57/64
3、）。2.3等位基因脱扣率KG8的等位基因脱扣率为25.64%（10/39），CW4的等位基因脱扣率为25％（4/16），CW2的等位基因脱扣率为7.01%（4/57），在B患者中有1个淋巴细胞的两个位点同时发生ADO，发生率为2.56%（1/39）。2.4阴性对照阴性对照未发现阳性结果。3讨论ADPKD是一全身性疾病，目前尚无特异的治疗措施，只是一些对症治疗和延缓多囊肾病向ESRD进展的干预措施，多数患者最终将发展到终末期肾衰而不得不进行肾脏替代治疗和肾移植手术。为此，有必要对有ADPKD发病倾向的家庭成员，进行症状前诊断，以改
4、变其生活方式，远离高危致病因素，达到延缓和防止该病的发生。伴随着辅助生殖技术日益成熟的今天，PGD越来越受到世人的关注，对配子或着床前的胚胎进行遗传物质分析，选择没有遗传物质异常的胚胎移植，既能防止患儿的出生，又能避免流产、引产给夫妇双方带来的生理和心理上创伤。自1990年诞生了世界第一例经PGD的健康女婴以来〔7〕，世界上已经进行了6000多个PGD周期、至少1000个左右的经PGD诊断后的正常孩子出生〔8〕。但是由于ADPKD的致病基因庞大、结构复杂，有较多的重复序列、突变可能涉及整个基因，种类多并缺乏突变热点，因此目前AD
5、PKD常用的遗传学诊断方法是采用对与致病基因紧密连锁的微卫星进行连锁分析。本研究应用的与PKD1连锁的KG8、SM6、CIM173900,PKD1andPKD2genes,proteinproductsknoGe,2004,12(5):347～354.2梅长林,戴兵.多囊肾病慢性进展的分子发病机制及治疗进展.中国实用内科杂志，2007，27(1):53～55.3BurnTC,ConnorsTD,Dackoicsequencefortheautosomaldominantpolycystickidneydisease(PKD1)g
6、enepredictsthepresenceofaleucine-richrepeat.TheAmericanPKD1Consortium(APKD1Consortium).HumanMolecularGeics,1995,4(4):575～582.4HughesJ,ochizukiT,unneS,etal.Overadecadeofexperienceplantationgeicdiagnosis:amulticenterreport.FertilityandSterility,2004,82(2):292～294.9Verl
7、inskyY,RechitskyS,VerlinskyO,etal.Preimplantationgeicdiagnosisforpolycystickidneydisease.FertilityandSterility,2004,82(4):926～929.10De-RyckeM,GeorgiouI,SermonK,etal.PGDforautosomaldominantpolycystickidneydiseasetype1.MolecularHumanReproduction,2005,11(1):65～71.11Piya
8、mongkolG,HarperJC,etal.Detailedinvestigationoffactorsinfluencingamplificationefficiencyandalleledrop-outinsinglecellPCR:implication
