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《单细胞多重巢式pcr在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究作者：朱琴徐炳森黄学锋周颖【摘要】目的建立单细胞的多重巢式荧光PCR技术，为开展常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供依据。方法用四重荧光巢式PCR和毛细管电泳对单个淋巴细胞的KG8、SM6、CW4和CW2四个微卫星位点进行多态性分析。结果单个淋巴细胞KG8、SM6、CW4和CW2扩增成功率分别为％、％、％(59/64)和％，KG8、CW4和CW2的等位基因脱扣率分别为％、25°/。和％，两个位点同时发生的ADO率为％。结论该方法为常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供了依据。【关键词】微卫星多囊肾胚胎植
2、入前遗传学诊断AbstractlishthetechnologyoescencesinglecellPiongeneticdiagnosiantpolycystickidneequadruplexnestedfpillaryelectrophorolymorphismtypeofKsinglelymphocytes.ObjectiveToestabfmultipienestfluorCR:forprEimplantatsforautosomaldominydisease.MethodUsluorescentPCRandcaesistoanalysisthepG8,SM6,CW4a
3、ndCW2ofResultTheamplificationsuccessrateofre%,%,%and%,respecKG8,CW4andCW2are%,Ois%intwomicrosatemultaneous.ConclusKG8,SM6,CW4andCW2atively,andtheADOof25%and%,WhiletheADllitesdiscoveredsiionItprovideanevidenceofusingthistechniqueforthePGDforADPKD.KeywordsMicrosatelliteADPKDPrEImplantationgenet
4、icdiagnosis常染色体显性多囊肾疾病是最常见的常染色体显性遗传的单基因遗传病，人群发病率为1/1000［1］。ADPKD的主要表现为肾脏进行性囊性改变，常导致终末期肾病，居我国终末期肾病病因的第4位［2］。除了肾脏病变外，还累及全身多个器官，如肝嚢肿、高血压、颅内动脉瘤、心瓣膜畸形等，是一全身性疾病。而且ADPKD具有延迟性发病的特点，其症状发生前检查结果很少能影响未生育患者的生育意向，使其成为最易遗传给下一代的严重遗传病之一。因此，对ADPKD患者进行PGD既可满足患者生育的愿望，又可避免生育患有ADPKD的后代。目前认为，ADPKD主要与PKD1和PKD2基因有关，P
5、KD1突变引起的ADPKD占80%〜85°/。［3,4］，PKD2基因突变引起的ADPKD占10%〜15%［5］，这两个基因结构复杂，缺乏突变热点，因此难以通过直接检测突变行PGD诊断。本研究拟利用与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4和CW2四个微卫星位点，行四重巢式荧光PCR和毛细管电泳，为ADPKD的PGD研究提供诊断依据。1材料与方法实验材料任取2位来本中心就诊患者的淋巴细胞64个，其中A患者获取18个，B患者46个。取材均得到患者的同意。实验方法单个琳巴细胞制备：先用percO1160分离出单个核细胞，然后在倒置显微镜下通过显微操作吸取单个淋巴细胞，分别在3滴PBS
6、液中洗涤，同时取最后1个微滴洗涤后液体为阴性对照，将单个琳巴细胞转移于含5ul细胞裂解液的PCR管中，一20°C保存备用。PCR反应：KG8、CW4和CW2的内引物参考文献［6］，其余引物均由primer3软件自动生成。内引物中正引物均有FAM荧光标记。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体内外引物序列见表1。第一轮PCR:64个淋巴细胞均应用四重巢式PCR，同时扩增微卫星KG8、SM6、CW4、CW2,反应体系均为50ul，其中模板含5ul细胞裂解液的单个卵裂球，lOXPCRbufferul,dNTP3u1,镁离子u1，KG8和CW2正反引物各加2u1，SM6和CW4
7、引物各加3ul，HighFidelityTaq酶ul，用水补充至50Pl。先灭活蛋白酶K，45°Clmin,96°C20min，然后在72°C时将上述反应液加入到模板里，96°Clmin,96°C30s,58°C,72°Clmin,共25个循环，最后72°C再延伸lOmin。lOPCRbuffer、dNTP、镁离子和酶均由invitrogen公司。第二轮PCR：反应体系均为10ul，KG8反应体系为10XPCRbufferlul,1OmM的dNTPu1，5mM镁离子ul，10uM
