应用多重巢式pcr的方法检测急性髓系白血病中mll融合基因之临床意义研究

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1、应用多重巢式PCR的方法检测急性髓系白血病中MLL融合基因之临床意义研究第一部分433例急性白血病中MLL相关11种融合基因的检测发生率及临床特点前言临床上以贫血、出血、感染和髓外浸润为主要表现，病情进展迅速，死亡率高[1]。MLL基因定位于11号染色体长臂2区3带(11q23)。片段大小为92kb，至少包括36个外显子，是血液系统恶性疾病中常累及的基因之一[2]。MLL相关急性白血病具有独特的临床及分子遗传学特征，多提示预后不良[3]。目前已发现，除13号及Y染色体外的其余22条染色体均可与11q23发生融合，产生融合基因，已证实的

2、伙伴基因达50-60余种[4]。MLL伙伴基因的多样性提示该基因在白血病的发生中起了重要的作用。因此研究MLL基因阳性的白血病的发生机制及治疗进展，为高危白血病治疗提供了指导作用。MLL基因的重排对白血病诊断，治疗方法的选择，及微小残留病的检测均有重要的意义。MLL基因阳性的白血病有其自身的特点如白细胞升高，肝脾肿大，髓外受累，淋巴结肿大，中枢神经系统受累等等。此外MLL基因阳性白血病常规化疗难以缓解，缓解后易复发，预后差，平均生存期短，治疗难度较大。这种高危类型白血病异基因移植效果明显优于常规化疗[5]。MLL融合基因阳性血液病可见

3、于治疗相关白血病，急性髓系白血病，急性淋巴细胞白血病，骨髓增生异常综合征(MDS)及70%-80%的儿童ALL急性淋巴细胞白血病及35%左右的儿童AML等等[6]。此外含有MLL-AF9的MDS无论原始细胞多少均诊断为AML[1]。据文献报道MLL基因异常或者应用FISH的方法检测到11q23染色体异常与白血病预后不良有关系[7,8]。11q23染色体易位是急性白血病较常见的易位，此易位产生的融合基因是MLL基因和其余50多种基因之一融合而产生的[9]。应用多重巢式PCR采用2轮平行设置多组含有混合引物的多重PCR方法，同时检测多种目

4、的基因，具有简便、经济、高效、准确的优点，该方法优于染色体核型和southernblot法。多重巢式PCR技术检测融合基因的应用范围广泛，它不受染色体中期分裂相数目的影响，可以检测微小克隆异常。它不仅可以识别少见的染色体易位，也能检测出隐匿的染色体异常，这就为临床MRD检测提供了先进的检测方法[10]。应用该方法检测AML中MLL相关11种融合基因，可以快速、灵敏、有效地识别融合基因，从而为AML的诊断、治疗策略的制定、化疗后微残监测及预后分析提供重要理论依据。筛出MLL相关基因阳性后，RQ-PCR的方法，对MLL融合基因进行定量分析

5、，在每周期化疗前后，及造血干细胞移植前后分别动态观察该基因的水平。为微残的监测提供依据。能尽早及时发现白血病的复发倾向，为白血病的治疗提供指导。..材料与方法1.材料1.1研究对象中国人民解放军总医院血液科从2008年4月至2011年11月诊治的433例AML者（所有患者均经过骨髓细胞形态学确诊，且排除其他肿瘤性疾病）所有患者均签订了知情同意书，并且获得我院伦理委员会批准。1.2多重巢氏PCR检测1.2.1主要仪器与试剂1.2.2仪器[11]生物安全柜：德国THERMOL公司。超净工作台:北京半导体设备一厂。二氧化碳培养箱:Herae

6、uS德国西门子公司37℃，5%C02，饱和湿度。低温高速离心机:5417R型，Eppendorf公司。离心机:Jouan，法国;上海安亭科学仪器厂;B600A型，白洋。电热恒温水浴箱:北京市光明医疗仪器厂。PCR仪:veriti96alcyCler(AppliedBiosystemS)。光学显微镜:01ympus，日本。定量PCR仪：7900(AppliedBiosystemS)。流式细胞仪：美国BD公司。测序仪：3500(AppliedBiosystemS)。凝胶扫描仪:美国Kodak公司产数码相机及相应图像分析软件系统。染色体分析

7、系统：德国LEICA公司。微量移液器:GILSON，法国。电子天平:Sartorius，德国。电泳仪:北京六一仪器厂。冰箱:SANYO，日本，-86oC;海尔，中国，-20oC，4℃。紫外分光光度仪:AmershamBioSCienCeS公司。.2.实验方法取EDTA抗凝骨髓标本,按四色免疫荧光直接标记法操作。各测试管均标记CD45PerCP(多甲藻叶绿素蛋白),四色标记时再加入别藻蓝蛋白(APC)标记的抗体。检测的抗体包括CD10,CD34,CD19,CD9，CD38,CD22,CD20,CD13,CD117,CD11b,CD33,

8、CD79a及HLA-DR等单抗(BD或BDPharMingen公司产品)。用FACSort流式细胞仪(BD公司)获取10000个细胞,通过CD45设门分析不同细胞群及各群细胞抗原表达情况,并对异常幼稚细胞群进行免疫分型分